蓓萨罗丁(Bexarotene, BEX)是一种新型的维甲酸类药物,可以选择性激活维甲酸X受体,调控基因表达,具有显著的抗肿瘤活性。2000年,蓓萨罗丁口服软胶囊和外用凝胶剂获美国药品食品管理局(FDA)批准上市,主要用于皮肤T-细胞淋巴瘤的治疗。近年来,蓓萨罗丁在肺癌、乳腺癌和卵巢癌等癌症治疗中的应用也受到广泛关注。但是蓓萨罗丁有一定的毒副作用,水溶性较差,缺乏给药靶向性,临床应用受到了严重限制。因此,亟需开发新型有效的给药系统,增加肿瘤部位的药物浓度,提高药物的抗肿瘤疗效。白蛋白是一种无毒无免疫原性、生物可降解、生物相容性良好的载体材料,白蛋白纳米粒在药物缓释靶向系统中应用广泛。叶酸作为一种靶向因子,可以与多种肿瘤细胞膜(如卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌等)表面上的叶酸受体结合,因此表现出较高的肿瘤细胞亲和力。本课题以蓓萨罗丁为模型药物,以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)为载体材料,首先采用去溶剂化法(desolvation technique)制备了蓓萨罗丁白蛋白纳米粒(Bexarotene-loaded bovine serum albumin nanoparticles, BEX-BSANPs)。再利用纳米粒表面的活性氨基和叶酸的羧基进行酰胺化反应,制备了叶酸修饰的蓓萨罗丁白蛋白纳米粒(folate-modified bexarotene-loaded bovine serum albumin nanoparticles, FA-BEX-BS ANPs),并考察了该给药系统的构建方法、理化性质、体外抗肿瘤活性、大鼠体内药物动力学特征等。本研究的主要内容包括：1、蓓萨罗丁白蛋白纳米粒的处方前研究根据紫外扫描图谱确定了BEX的最大吸收波长为260 nm。建立了BEX的高效液相色谱检测方法：方法学考察结果表明其线性关系在0.25～80.00 μg/mL浓度范围内良好,方法的专属性、日内精密度、日间精密度和回收率符合测定要求。采用超速冷冻离心法测定蓓萨罗丁白蛋白纳米粒的包封率和载药量,方法回收率符合要求,操作简单可行。2、叶酸修饰的蓓萨罗丁白蛋白纳米粒的制备研究单因素考察法实验结果为：精密称取一定量的BSA溶于水中,制得BSA水溶液(1.5%,w/v),调节pH至9.0。加入一定量BEX的乙醇溶液,孵育1h后,在25℃恒温水浴中,500 r/min的恒速搅拌下,以1.5 mL/min的速度滴加一定量的无水乙醇。最后加入戊二醛交联固化24 h,在40℃、真空条件下减压蒸馏除去乙醇。用超速冷冻离心机离心三次(4℃,20,000 rpm,20 min),所得沉淀用蒸馏水稀释至原体积即得BEX-BSANPs。酰胺化反应实验结果为：精密称取一定量的FA溶于二甲基亚砜(DMSO),加入等量的EDC和NHS(均为叶酸摩尔量的5倍),避光反应20 min后,将活化的叶酸(NHS-FA)滴加至BEX-BSANPs溶液(pH=10)中。在恒定转速下室温反应12 h。用超速冷冻离心机离心三次(4℃,20,000 rpm,20 min),所得沉淀用蒸馏水稀释至原体积即得FA-BEX-BSANPs。优化工艺操作简单,所制备的BEX-BSANPs和：FA-BEX-BSANPs包封率稳定,平均包封率为78.12±0.45%、65.45±0.55%,载药量为7.96±0.46%、5.36±0.79%。透射电镜观察结果表明所得纳米粒为球形,粒径分布较窄,平均粒径小于200 nm,Zeta电位分别为-25.51±1.42 mV、-33.64±1.97 mV。叶酸平均偶联效率为71.28±1.93 μg FA/mg BSA。3、叶酸修饰的蓓萨罗丁白蛋白纳米粒冻干工艺研究FA-BEX-BSANPs冻干工艺为：加入5%(w/v)甘露醇作为冻干保护剂,-80℃下预冻24 h,将制剂至于真空冷冻干燥机中冻干48 h。DSC和XRD结果表明,冻干粉针剂中的BEX以无定形的形式存在,不再是晶体结构,说明BEX完全包裹或吸附于载体材料中,形成了新的物相。将FA-BEX-BSANPs冻干品分别在冷藏(4℃)和室温(20～25℃)条件下贮存3个月,其外观、粒径、包封率和载药量等均无较大的改变,表明冻干过程对FA-BEX-BSANPs的稳定性没有影响。用透析法对冻干粉针剂的体外释药特性进行考察,结果表明在pH 7.4的PBS中,FA-BEX-BSANPs具有明显的药物缓释作用,12h累积释放BEX不到40%,72 h的药物累积释放率为76.21±1.65%,96h基本释放完全。4、蓓萨罗丁白蛋白纳米粒体外抗肿瘤活性评价MTT考察结果表明空白纳米粒对MCF-7细胞和A549细胞均无明显的毒性。BEX原料药溶液(BEX-SOL)和两种BEX纳米粒对两种细胞均有抑制作用。其中,FA-BEX-BSANPs的抗肿瘤作用最强,且与叶酸受体低表达的A549细胞[FR-negative, FR(-)]相比,其对叶酸受体高表达的MCF-7细胞[FR-positive, FR(+)]的抑制作用更显著。细胞摄取结果表明,MCF-7细胞和A549细胞对载香豆素-6纳米粒的摄取均强于游离香豆素-6溶液,且MCF-7细胞[FR(+)]对叶酸修饰的靶向纳米粒的摄取明显强于普通纳米粒。MCF-7细胞对靶向纳米粒的摄取可被游离的外源性叶酸抑制,而A549细胞[FR(-)]则不具有上述靶向性特征。由此推断,靶向纳米粒可以借助肿瘤细胞表面的叶酸受体介导的胞吞作用入胞。5、蓓萨罗丁白蛋白纳米粒大鼠体内药物动力学研究以BEX-SOL为对照,采用HPLC法考察载药纳米粒经尾静脉注射后在大鼠体内的药物动力学行为。数据分析结果表明,与BEX-SOL相比,制剂组明显改变了药物在大鼠体内的药动学过程,药物的初始浓度低,血药浓度-时间曲线更持久。静脉注射BEX-BSANPs和FA-BEX-BSANPs后,药物平均滞留时间MRT(o-∞)从2.365 h分别延长至6.085 h和6.435 h,药时曲线下面积AUC(0-∞)从28.445 mg/L.h分别增大至49.305 mg/L·h和52.527 mg/L·h,清除率CL从0.476 L/h/Kg分别下降至0.283 L/h/Kg和0.267 L/h/Kg。说明经静脉注射给药后,白蛋白纳米粒可以显著降低药物的消除速度,延长其体内循环时间,有助于药物缓释及提高生物利用度。综上所述,本课题首次成功构建了叶酸修饰的蓓萨罗丁白蛋白纳米粒双重靶向给药系统,利用纳米粒的粒径大小实现一定的被动靶向,利用叶酸受体在多种癌细胞表面的高表达性实现主动靶向,将药物有效地输送至病变部位。本论文的研究内容国内外尚未见报道,为提高难溶性药物的疗效和靶向性提供了新思路,为临床治疗肺癌、乳腺癌等肿瘤相关疾病提供了一种安全有效的方式,对于设计开发新型受体介导的肿瘤细胞内靶向给药系统具有重要的实践意义。