子宫内膜癌肿瘤源性微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

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目的:   子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,发病率约占女性总癌症的7%,它的发生、发展、侵袭及转移与新生血管密切相关。对肿瘤新生血管的研究已成为当前抗肿瘤研究的热点,被认为是非细胞毒性肿瘤治疗中最有前途的方法之一。内皮细胞是肿瘤血管生成的关键细胞,它的激活在血管生成中起关键作用,分离和培养肿瘤源性微血管内皮细胞对研究肿瘤血管生成机制和抗血管生成药物筛选具有重要意义。免疫磁珠技术是一种新的免疫学技术已成为近年来国内外研究的热点。免疫磁珠由载体微球和免疫配基结合而成,具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度专一性,所以它在免疫检测、免疫吸附、细胞分离培养等领域得到越来越广泛的应用。本实验应用传统的细胞分离法结合免疫磁珠技术,以建立人子宫内膜癌微血管内皮细胞的原代分离培养方法并研究其体外免疫组化特征。   方法:   采用免疫磁珠技术结合传统的I型胶原酶消化法及筛网过滤法从新鲜的子宫内膜癌组织中分离纯化肿瘤相关微血管内皮细胞,将分离出的内皮细胞应用台盼蓝拒染实验来检测其活力,采用含有20%FBS、30ug/mlECGS、0.2U/ml胰岛素、10U/ml肝素、5ug/ml氢化可的松和100U/ml青、链霉素的M199培养基进行培养,待细胞铺满培养皿的70-80%时用0.25%胰酶消化按1:2比例进行传代。通过流式细胞仪检测微血管内皮细胞的纯度,光镜下观察细胞的形态及生长状态。取第2、3代对数生长期的细胞进行细胞爬片后,选择常用的内皮细胞标志物CD31和vWF因子,采用细胞免疫荧光技术对其进行鉴定。将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液以相同的细胞密度接种到96孔板上,通过MTT法测定获得微血管内皮细胞的生长曲线。   结果:   本法获得的微血管内皮细胞台盼蓝拒染率为90%,纯度可达95%,免疫磁珠吸附的原代细胞单个或成团状漂浮在培养基中,绝大部分能在24h内贴壁,贴壁细胞呈梭形、星形及多边形,铺满后呈现铺路石样外观,细胞单层生长有接触抑制现象,可连续传代。原代细胞一般7-9d完全融合,传代培养后约5-6d可传代一次。经MTT法测定得到的微血管内皮细胞体外生长曲线呈“S”型。免疫荧光证实传代细胞表达内皮细胞特异性vWF因子及细胞间粘附蛋白CD31。   结论:   本研究摸索并建立了人子宫内膜癌微血管内皮细胞的分离培养方法,所获得的细胞活力强、纯度高,可连续培养传代,可用于子宫内膜癌的相关研究,为探讨子宫内膜癌的临床治疗方法提供了新的平台。
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