益生菌是定植在肠道及许多重要器官中的微生物。在消化系统中,益生菌能够辅助肠道生成多种代谢产物,并且参与消化系统及免疫系统的构建。目前已经分离及鉴定出多种益生菌,并且多数已经作为安全的食品添加剂投入到生产中,例如,酸奶及其他发酵食品中的乳酸杆菌。鼠李糖乳杆菌CGMCC是一株新鉴定的中国益生菌菌株。在本研究中,我们对化学试剂诱导大鼠结肠癌模型的安全性进行评估,并且对模型中肠道微生物组的结构进行检测分析,对血清中多种细胞因子及血清脂蛋白谱的变化进行检测。目的:本研究旨在研究鼠李糖乳杆菌CGMCC在二甲肼(DMH)诱导的大鼠结肠癌中的抗肿瘤活性及其可能介导的免疫治疗活性。方法:1将大鼠分为四组,GCO是空白对照组,GLR是仅使用鼠李糖乳杆菌灌胃组,GCA是单纯DMH诱导大鼠结肠癌组,GCL是在DMH诱导大鼠结肠癌后使用鼠李糖乳杆菌治疗组。GCL组使用鼠李糖乳杆菌菌种1.2134(CGMCC)1x109CFU/ml对大鼠进行灌胃,连续2周。然后对大鼠进行DMH40mg/kg腹腔注射,连续10周。在注射DMH同时也进行CGMCC菌液灌胃,持续至第26周。2、在第10周处死一半大鼠,用于隐窝病灶异常的评估,其可以视为早期肿瘤的发生。其他的大鼠在第24周处死(从第一次DMH注射起计时)。使用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)及蛋白质免疫印迹技术检测结肠组中的细胞凋亡情况。3、使用流式细胞术检测在第10周和第24周的免疫应答情况,分析Th1,Th2,Th17细胞因子(IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNFα,IFNγ和IL-17a),同时对血清脂蛋白谱进行分析。用蛋白质印迹,qRT-PCR和组织学评分分析第10周及24周时结肠组织的炎症和肿瘤标志物的变化情况。4、在两个时间点处收集大鼠的粪便,并进行基因组微生物组DNA提取,然后使用Illumina Hi-Sequencer系统进行16S rRNA测序。得到的数据以假设操作分类单位OTUs的形式进行分析,序列读数(2x150 bp配对末端)。在分析中,规定操作分类单位(OTU)具有97%以上的相似性的序列视为同一物种。此外,使用核糖体数据库(RDP)初步分析所得的所有序列。QIIME软件处理后得到样本的α和β多样性。使用Reconstruction Unobserved State(PICRUSt)分析样本代谢通路,并且使用Statistical Analysis of Metagenomics Profiles(STAMP)软件分析KO level2,level3和COG,以明确各组之间的代谢物差异。结果:1、在注射化学药物DMH早期(诱导后第10周),我们发现,GCL组(149±68)中的ACF数量明显低于GCA组(269.5±137)。并且,我们注意到,与GCA组相比,Bax,P53和Caspase-3蛋白表达显著增加,NFkB-p65,Cox2和β-catenin表达显著下降。2、对第10周大鼠血清中的细胞因子进行检测发现,GCL组大鼠血清中IL-2,IL-6和IFN-γ的含量增加,同时,该组中IL-10的含量下降。3、16S rRNA粪便微生物组基因组分析表明,LBR在门、科及属等多种水平上改变了肠道微生物组的结构,菌群组成以及功能。总而言之,在这一时间截点,我们发现LBR通过抑制促癌生物标志物和调节肠道菌群结构降低结肠ACF的发生率和多样性。4、在化学诱导结肠癌的第24周,灌胃LBR显著降低大鼠中肿瘤的发生率及多样性。与GCA组相比,GCL组中的大鼠生成肿瘤的比例明显下降(p=0.016)。此外,GCA与GCL组在形成的肿瘤体积上也有明显的差异(p=0.05)。我们发现,在此阶段,TUNEL检测发现GCL组中处于肿瘤微环境的凋亡细胞数量明显增加,并且这一结果通过蛋白质印迹实验得到进一步验证。此外,增加的巨噬细胞和成纤维细胞因子标记物和可能活化的T细胞免疫应答反应可能介导癌细胞凋亡数量的增加。此外,LBR能够保护肠道上皮的完整性,并减弱上皮间质转化的发生。16SrRNA测序发现鼠李糖乳杆菌能够改善肠道菌群的结构,并调节肠道代谢产物,改善肠道功能。结论:鼠李糖乳杆菌的早期干预具有保护作用。它通过增强肿瘤微环境中的免疫应答以及改善肠道菌群的结构和肠道代谢物的组成预防早期肿瘤的发展。