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目的: 探讨DKI(diffusion kurtosis imaging,磁共振扩散峰度成像)对HIBD(hypoxic ischemic brain damage,缺血缺氧性脑损伤)大鼠病变区域损害程度及细胞凋亡程度的评价价值,并通过建立MRI体外活体监测程序,对一种新型的SD大鼠缺血缺氧性脑损伤治疗方法——侧脑室注射SPIO标记BMSCs磁性靶向导引法,进行监测示踪及疗效评估。 方法: 1.SPIO-PLL标记BMSCs的制备 取用6~8周健康的SD(sprague-Dawle)雄性大鼠,手术得到骨髓细胞悬液后,将细胞接种、培养,收集3~5代细胞。用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。流式细胞法检测细胞表面抗原CD29+、CD90+、CD45-、CD11b-的表达。 取适量的SPIO和PLL加入DMEM培养基中制得SPIO-PLL混合液。将BMSCs接种于DMEM培养基中孵育12~24h。采用普鲁士蓝染色试剂盒检测SPIO-PLL标记BMSCs的有效率,台盼蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测标记细胞增殖能力。 2.HIBD模型制作 各组模型均采用SD大鼠,日龄:7d;体重11.5g~15.6g;性别:雄性。假手术组取7d龄新生SD大鼠,分离出左侧颈总动脉,然后缝合皮肤,碘伏消毒,放入饲养环境中恢复;HIBD组取7d龄新生SD大鼠,分离出左侧颈总动脉,并用手术线双重结扎左侧颈总动脉,缝合伤口,整个手术过程需在5min内完成;置于原饲养环境中恢复30min,然后转移至37℃乏氧箱内,控制氧浓度为8%(7%~9%),氧浓度全程由测氧仪监测,湿度为70%±5%,持续缺氧2h;HIBD组在建立HIBD模型24h后,将SD大鼠用手钻破开颅骨,用注射器针头扎破硬脑膜;用微量注射器抽取5μlDMEM培养液,注射器进针深度3mm,按照1μl/min速度缓慢匀速注入,注射完成后留针5min,缓慢退出针头,骨蜡封闭骨孔,缝合皮肤。侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组在建立HIBD模型24h后,将SD大鼠用手钻破开颅骨,用注射器针头扎破硬脑膜;用微量注射器抽取5μl细胞悬液,细胞数约为1×105个,注射器进针深度3mm,按照1μl/min速度缓慢匀速注入,注射完成后留针5min,缓慢退出针头,骨蜡封闭骨孔,缝合皮肤。侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组在侧脑室注入后24h,在大鼠左侧头部固定磁铁2h。鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组在建立HIBD模型24h后,用微量注射器抽取5μl细胞悬液,细胞数约为1×105个,穿刺鼠尾两侧的鼠尾静脉,将细胞悬液注射入鼠尾静脉内,并用1ml生理盐水冲管。 3.动物分组 将实验动物分为假手术组、HIBD组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组和鼠尾静脉注入SPIO-PLL标记BMSCs组;假手术组8只,HIBD组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs导引组和鼠尾静脉注入SPIO-PLL标记BMSCs组各16只;在实验过程中,各组均未发生大鼠死亡事件;假手术组按照各时间点取脑分别为1W2只,2W2只,3W2只,4W2只,其余各组按照各时间点取脑分别为1W4只,2W4只,3W4只,4W4只。 4.MRI检查技术 对大鼠进行MRI检查,时间点分别为各实验组HIBD模型制作后1W、2W、3W、4W;对照组为假手术后1W、2W、3W、4W。扫描序列包括T1WI、T2WI、T2-FLAIR、SWI、DKI。 磁共振扫描仪:SIEMENS3.0T磁共振扫描仪,型号:VERIO,厂家:德国西门子医疗集团。线圈:3.0T5cm动物专用线圈,4通道,型号:CG-MUC18-H300-AS,生产厂家:上海晨光医疗科技有限公司。 DKI分别扫描三组数据:DKI0、DKI1、DKI2;DKI0b值为0,DKI1、DKI2参数相同,b值分别为1250、2500,弥散方向30个;使用Diffusion Kurtosis Estimator(DKE)将DKI中原始DICOM格式图像转换成nii格式文件;其中参数设置为B-values:0,1250,2500;FWHM:4.21875,4.21875,4.21875(1.25*voxel size);Gradient Vectors:simens VB13-1730-direction;转换生成fa.nii、kfa.nii、kmean.nii、kax.nii、krad.nii、mkt.nii文件,用于数据测量。 运用image J软件打开nii文件,分别测量侧脑室后角旁脑白质测量,大鼠脑内ROI(region of interest,感兴趣区)手动勾画然后测量,以大鼠的常规MRI图像为参照,明确解剖位置。每个ROI测量3次,ROI控制4个体素左右,为减轻手动测值伪影,在一周后再测。取两次测值的平均值;KFA(diffusional kurtosis anisotropy,扩散峰度各向异性)、MK(mean kurtosis,平均峰度)、Kax(axial kurtosis,轴向扩散峰度)、Krad(radial kurtosis,径向扩散峰度)、MKT(mean kurtosis tensor,平均峰度张量)值。 结果: 1.在常规MRI检查中,假手术组与HIBD组显示SD大鼠脑病变区域均不明显;在DKI数据中,对照组与HIBD组的KFA、MK、MKT值差异显著,存在统计学意义,P<0.05; 2.各治疗方案结果显示,平均峰度MK随着时间进展,HIBD组与鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组MK值先增高后减低,而侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组与侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组MK值呈逐步下降改变,且最终鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组MK值低于HIBD组,侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组MK值较鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组更低,侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组MK值为各治疗组最低,各组差异值显著,存在统计学意义,P<0.05;随着时间进展,HIBD组、鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组、侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组及侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组KFA值依次减低,且差异值显著,存在统计学意义,P<0.05;MKT值随着时间进展,HIBD组数值显著升高,鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组MKT值下降,但仍高于侧脑室注射组数值,而侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组最低,且各组差异具有统计学意义,P<0.05,表明相对于其他两种治疗方式,疗效更好。Kax与Krad各组差异不具有统计学意义,P>0.05。 3.病理结果显示,假手术组各时间点大脑均为轻度水肿,凋亡检测为阴性;HIBD组随着时间进展大脑逐步明显水肿,后期出现大量神经元变性坏死,神经元红色变,小胶质细胞片状增生,凋亡检测各时间点均为强阳性;鼠尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组随着时间进展大脑水肿逐步加重,后期发现多数神经元变性、红色变,小胶质细胞灶状增生,凋亡检测早期阳性,后期强阳性,较HIBD组略有减轻;侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs组大脑呈轻度水肿,后期可见部分神经元变性、红色变,少量小胶质细胞灶状浸润,凋亡检测早期阳性,后期弱阳性,较尾静脉注射SPIO-PLL标记BMSCs组治疗效果更好;侧脑室注射SPIO-PLL标记BMSCs后磁性导引组各时间点大脑均为轻度水肿,未见明确大量神经元变性坏死,凋亡检测早期为弱阳性,后期呈阴性,治疗效果相对于其他两组效果更好。各组病理结果与DKI结果相一致。 结论: 1.MRI DKI可以有效反映大鼠缺血缺氧性脑损伤水平及细胞凋亡程度; 2.MRI DKI可以对SPIO标记间充质干细胞治疗SD大鼠缺血缺氧性脑损伤的疗效进行评价; 3.新型侧脑室注射SPIO标记BMSCs磁性导引靶向给药方式对SD大鼠缺血缺氧性脑损伤治疗有效,且治疗效果相对于鼠尾静脉注射给药及单纯侧脑室注射给药更好。