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目的:研究calpains在死亡早期肌原纤维骨架蛋白降解中的作用；通过组织细胞原位观察、亚细胞水平和分子水平三个层次进行规律性摸索，探讨该规律与死亡时间之间的相关性，分析此规律用于推断死亡时间的可行性，为法医工作者推断死亡时间提供新的科学参数。
方法:取6只健康清洁级家兔，空气栓塞处死，置于室温23±1℃的环境下，在死后不同时间段：0，2，4，8，12，18，24，32，40，48h取其背部肌肉，按照不同死亡时间段分成九组。课题由以下4个部分组成：
第一部分：calpains对死亡早期肌原纤维骨架蛋白降解作用的研究。取Oh肌组织8份，称重，每两份用微量注射器按10％体积／重量比分别注射蛋白酶抑制剂PMSF、Aprotinin和Leupeptin以及添加剂DMSO，设立对照组，共4组进行蛋白酶抑制实验。经过组织匀浆、梯度离心、过滤、总蛋白定量等步骤，继而进行SDS-PAGE和Westem-blo~ing，结合凝胶和转印膜观察各条带的变化，根据各种抑制剂所抑制的酶的种类的不同，得出死后早期肌原纤维骨架蛋白主要受calpains的降解。
第二部分：细胞水平观察desmin降解与死亡时间的相关性。家兔处死后分6个时间段取材，用4％中性甲醛固定，随后制成石蜡切片，以小鼠抗兔desmin为一抗，采用ABC法进行免疫组织化学观察，利用图像分析技术寻找图像的平均灰度值与死亡时间之间的规律性。
第三部分：亚细胞水平研究肌原纤维小片化指数与死亡时间的相关性。肌组织经过匀浆、梯度离心、总蛋白定量后稀释成0．5mg／ml，该浓度下的肌原纤维混悬液于540nm处的吸光值×200即为所对应时间段下的肌原纤维小片化指数，继而统计分析该指数同死亡时间之间的关系并进行方程回归。
第四部分：分子水平研究desmin降解与死亡时间的相关性。取第三部分匀浆后的样品测定蛋白浓度，将各时间段蛋白浓度稀释成统一浓度10mg/ml，用Q—actin作内标进行SDS-PAGE和Western-blotting，后利用凝胶成像系统分析各条带的灰度值和内标之间的比值，继而统计分析和方程回归。
结果:1、死后48小时，注射PMSF、Aprotinin组的样品电泳条带情况同空白组一样出现多条新生条带，即PMSF、Aprotinin不影响死亡早期蛋白质的降解，而Leupeptin组未见明显新生条带，即Leupeptin明显影响肌原纤维骨架蛋白的降解；免疫印迹同样提示Leupeptin能明显抑制desmin的降解，而PMSF及Aprotinin无此作用。
2、死亡后8小时内，骨骼肌肌细胞横纹结构未见有明显的改变，但desmin染色颗粒整体变淡；死后16小时骨骼肌横纹结构清晰，但desmin染色颗粒则出现不均匀分布；死后24小时骨骼肌肌细胞可见较明显的脱颗粒改变，脱颗粒区染色变淡、横纹结构尚清晰：死后36小时骨骼肌肌细胞出现较大范围的脱颗粒改变，缺染区横纹结构尚清晰；死后48小时大部分骨骼肌肌细胞明显脱颗粒，缺染区横纹结构消失。
3、随着死亡时间的延长，兔骨骼肌肌原纤维小片化指数逐渐的上升，且在死后24小时内降解速率较快，死亡时间(y)和MFI值(x)线性相关性良好，相关系数1=0．961，线性回归方程为：y=O．5605x-026．8269；24小时后肌原纤维降解速率缓慢，死亡时间和MFI值之间的线性关系不强。
4、随着死亡时问的延长，desmin／a-actin值逐渐地减小，desmin／Q—actin值(y)与死亡时间(x)线性回归方程为：y=一O．0217x+1．27M；相关系数r=O．9454。
结论:机体死后早期，肌原纤维骨架蛋白主要在calpains的作用下发生降解，从而出现较为规律性的变化。免疫组织化学方法在显微镜下观察desmin随着死亡时间的延长在骨骼肌内逐渐减少，能够直观地区分不同时间段间desmin的含量变化；采用图像分析技术进行半定量分析能够直观地反映出desmin降解在各时间段上的趋势，而且可进一步对这些数据进行统计分析；肌原纤维小片化指数则在死后24小时内表现出同死亡时间之间较为密切的相关性，并且该法取材广泛、操作简便、耗时少，所以该法可适用于较早期死亡时间的快速推断；通过westernblotting技术进行半定量研究的desmin／Q—actin比值与死亡时间之间有较强的线性关系，此方法适合用于早期的死亡时间推断，但该法操作较为繁琐、耗时较多，今后若能将操作方法和步骤进行进一步的简化，不失为一种较为可靠的死亡时间推断方法。