镉是重金属类环境内分泌干扰物的主要代表,广泛运用于电镀、化工、电子及核工业等领域,全世界储量巨大,易通过多种途径排入环境。目前,镉仍是全球六大主要的环境污染物之一。镉可通过受污染的水、空气和食物等进入人体,易在人体内蓄积且难以排出,造成包括雌性生殖系统在内的多器官不可逆性损伤。卵泡发育和甾体激素的合成、分泌贯穿了卵巢发育的全过程。既往的研究表明,性成熟动物镉暴露后可出现卵巢形态的破坏和激素合成障碍,影响卵巢结构的完整和功能的正常。还有研究表明,镉能通过干扰关键基因的表达而影响某些器官的正常生理状态,且该干扰作用与DNA甲基化/microRNA调控机制存在一定的联系。流行病学调查显示,镉暴露人群广泛,许多女性自幼年时期开始,便生活在镉暴露的环境中,直至成年。然而,在镉是否能影响此类人群的卵巢发育,该影响是否与成年后暴露出现的损害存在差异等方面,目前知之甚少,且缺乏深入的基因表达与调控机制探索。基于以上研究现状,我们建立了Wistar大鼠断乳至性成熟镉暴露的动物模型,研究镉对卵巢发育的影响,对卵巢发育相关基因表达的调控作用,以及基因的DNA甲基化/microRNA调控模式的变化,试图较系统地研究镉的卵巢发育毒性及其可能的分子调控机制,并进一步阐明环境因素与遗传因素的交互作用在其中所扮演的角色。研究结果对于提高镉暴露的预防和控制水平具有重要的指导意义。第一部分:断乳至性成熟镉暴露对大鼠卵巢发育的影响目的:通过建立断乳至性成熟镉暴露的大鼠动物模型,明确镉暴露对卵巢的形态发育是否存在影响及其相应的特点。方法:清洁级雌性Wistar大鼠48只,21日龄,45.8±2.5 g,按体重随机分为4组,每组12只,经适应性喂养后,以0,0.5,2.0,8.0 mg/kg.体重的氯化镉(Cd Cl2)灌胃,每日1次,每周6次,直至第75日龄。每三天记录一次体重,染毒结束后取卵巢称重并计算卵巢脏器系数;将卵巢固定、包埋、切片、HE染色计数各级卵泡,并计算构成比;应用透射电镜观察各不同剂量组卵巢卵泡的凋亡情况,并采用TUNEL法观察、计算卵泡的凋亡率;应用透射电镜观察卵巢颗粒细胞的超微结构。结果:1.染毒结束后,与对照组相比,高剂量组体重显著下降(p<0.01),中剂量组和高剂量组卵巢湿重和卵巢脏器系数均显著下降(p<0.05);2.与对照组相比,高剂量组原始卵泡构成比显著下降(p<0.05),中剂量组和高剂量组闭锁卵泡构成比显著升高(p<0.01),各组初级卵泡,次级卵泡,成熟卵泡及黄体的构成比均无明显变化(p>0.05);3.中剂量组和高剂量组在电镜下可见数目不等的凋亡小体;与对照组相比,中、高剂量组的TUNEL阳性卵泡在总卵泡中的比例显著升高(p<0.01);4.与对照组相比,低剂量组卵泡超微结构无明显改变,但中剂量组颗粒细胞出现排列松散,核膜皱缩,核周池扩张,线粒体、粗面内质网形态变化等表现。高剂量组颗粒细胞超微结构除了与中剂量组类似的表现之外,部分细胞的细胞膜缺失,细胞器散落在外,并可见裸核及红细胞等坏死征象。第二部分:断乳至性成熟镉暴露大鼠卵巢SCF/c-kit基因的表达及其DNA甲基化/microRNA改变目的:研究断乳至性成熟镉暴露对大鼠卵巢发育相关的SCF/c-kit基因表达的影响及其DNA甲基化/microRNA调控模式的变化,探讨SCF/c-kit基因在镉致卵巢发育障碍中的作用及意义。方法:整体动物模型同前,采用Real-time PCR和Western blot法检测卵巢SCF/c-kit基因的m RNA和蛋白表达水平,采用结合重亚硫酸盐测序法检测SCF/c-kit基因启动子区Cp G岛的甲基化水平,采用Real-time PCR检测与c-kit基因转录后调控相关的microRNA的表达水平,根据microRNA靶点预测工具的检测结果,采用Real-time PCR对可能参与SCF基因转录后调控的microRNA表达水平进行检测,并采用荧光素酶报告基因进行靶标验证。结果:1.与对照组相比,中剂量组和高剂量组SCF基因的m RNA表达水平显著下调(p<0.01),其蛋白表达水平在中剂量组(p<0.05)和高剂量组(p<0.01)亦显著下调;2.SCF基因启动子区Cp G岛的总甲基化率组间比较无显著差异(Fisher’s exact test,p=0.911);3.可能参与SCF基因转录后调控的microRNA(miR-449a,miR-132,miR-320):与对照组相比,中剂量组和高剂量组miR-449a的表达水平显著上调(p<0.05);各染毒组miR-132与miR-320表达水平无显著差异(p>0.05);4.SCF基因调控相关microRNA的验证:在miR-449a,miR-132,miR-320分别和野生型SCF共转染至载体之后,荧光素酶活性均未发生显著改变(p>0.05);5.与对照组相比,各染毒组c-kit基因的m RNA表达水平均显著下调(p<0.01),其蛋白表达水平在中剂量组(p<0.05)和高剂量组(p<0.01)显著下调;6.c-kit基因启动子区Cp G岛的总甲基化率组间比较无显著差异(χ2=6.813,p=0.078);7.c-kit调控相关microRNA(miR-193,miR-221,miR-222):与对照组相比,中剂量组和高剂量组miR-193,miR-221和miR-222的表达水平均显著上调(p<0.01);第三部分:断乳至性成熟镉暴露大鼠卵巢卵泡发育和甾体激素合成相关基因的表达及其DNA甲基化/microRNA改变目的:研究断乳至性成熟镉暴露对卵巢卵泡发育和甾体激素合成相关基因表达的影响及部分基因的DNA甲基化/microRNA调控模式的变化,探讨上述基因在镉致卵泡发育和激素合成障碍中的作用及其意义。方法:整体动物模型同前,采用Real-time PCR和Western blot法检测卵巢卵泡发育相关基因:Figlα,H1foo,AMH和卵巢甾体激素合成相关基因:St AR,CYP11A1,3β-HSD,CYP17A1,CYP19A1的m RNA和蛋白表达水平,采用结合重亚硫酸盐测序法检测启动子区含有Cp G岛的Figlα,CYP17A1和CYP19A1基因的DNA甲基化水平,根据microRNA靶点预测工具的检测结果,采用Real-time PCR对可能参与CYP17A1和CYP19A1基因转录后调控的microRNA表达水平进行检测。结果:1.与对照组相比,各染毒组Figlα基因的m RNA表达水平均显著下调(p<0.01),其蛋白表达水平在中剂量组(p<0.05)和高剂量组(p<0.01)显著下调;与对照组相比,高剂量组Figlα基因启动子区Cp G岛的总甲基化率显著升高(χ2=8.446,p=0.038);2.与对照组相比,各染毒组h1foo基因的m RNA表达水平均显著下调(p<0.01),其蛋白表达水平在高剂量组(p<0.01)显著下调;3.与对照组相比,高剂量组AMH基因的m RNA表达水平显著上调(p<0.01),其蛋白表达水平在中剂量组(p<0.05)和高剂量组(p<0.01)显著上调;4.与对照组相比,高剂量组St AR基因的m RNA表达水平显著下调(p<0.01),然而,St AR基因的蛋白表达水平在低剂量组显著上调(p<0.01),而在中剂量组和高剂量组显著下调(p<0.01);5.与对照组相比,各染毒组CYP11A1基因的m RNA表达水平均显著下调(p<0.01),其蛋白表达水平在中剂量组和高剂量组亦显著下调(p<0.05);6.与对照组相比,各染毒组3β-HSD基因的m RNA表达水平均显著下调(p<0.01),然而,3β-HSD基因的蛋白表达水平在低剂量组显著上调(p<0.01),而在中剂量组(p<0.05)和高剂量组(p<0.01)显著下调;7.与对照组相比,高剂量组CYP17A1基因的m RNA表达水平显著下调(p<0.05),其蛋白表达水平在中剂量组和高剂量组亦显著下调(p<0.01);CYP17A1基因启动子区Cp G岛的总甲基化率组间比较无显著差异(χ2=4.394,p=0.222);可能参与CYP17A1基因调控的microRNA中,与对照组相比,各染毒组let-7a与miR-98表达水平无显著差异(p>0.05);8.与对照组相比,中剂量组和高剂量组CYP19A1基因的m RNA表达水平显著下调(p<0.01),其蛋白表达水平在各染毒组均显著下调(p<0.01);CYP19A1基因启动子区Cp G岛的总甲基化率组间比较无显著差异(χ2=6.157,p=0.104);可能参与CYP19A1基因调控的microRNA中,与对照组相比,高剂量组miR-133a的表达水平显著上调(p<0.05);各染毒组miR-27a表达水平无显著差异(p>0.05)。结论:1.断乳至性成熟镉暴露可影响卵巢发育,导致卵巢湿重,卵巢脏器系数下降,原始卵泡构成比降低,闭锁卵泡构成比升高,并促进卵泡凋亡,破坏颗粒细胞超微结构,与性成熟后镉暴露所致卵巢损伤存在一定程度的相似性;2.SCF/c-kit基因m RNA和蛋白表达的下调在镉致卵巢发育障碍中发挥了重要作用;miR-193,miR-221和miR-222参与了镉致c-kit蛋白表达的下调;但启动子区Cp G岛甲基化并未参与镉作用下SCF/c-kit基因m RNA表达的调控,miR-449a,miR-132和miR-320也未参与SCF基因转录后调控过程;3.断乳至性成熟镉暴露干扰了卵泡发育相关基因Figlα,H1foo,AMH和甾体激素合成相关基因St AR,CYP11A1,3β-HSD,CYP17A1和CYP19A1的m RNA和蛋白表达;Figlα基因启动子区Cp G岛甲基化在其m RNA表达下调中发挥作用,但CYP17A1和CYP19A1基因启动子区Cp G岛甲基化水平未发生改变;miR-133a可能参与了CYP19A1基因蛋白表达下调的调控过程。