利用VIGS技术在番茄中验证与萜类等代谢调控相关的柑橘同源基因

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番茄果皮和果肉中能够积累萜类和类黄酮物质,是初生和次生代谢相关基因功能研究的良好模式材料。目前,人们对能同时调控番茄类胡萝卜素和类黄酮等代谢途径的转录因子知之甚少。病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)不需要遗传转化操作,可高效、快速地显著降低拟沉默基因的表达量,是研究转录因子功能的重要技术手段。本研究以Micro-Tom番茄为材料,以TRV-PDS为阳性对照,利用VIGS、qRT-PCR及HPLC、GC-MS、LC-MS等分析检测技术对7个柑橘同源基因进行筛选,结果表明:  利用双酶切技术,已成功构建TRV-DS阳性对照及7个柑橘同源基因的沉默载体;通过叶片渗透、果柄注射两种方法侵染番茄植株,数天后,在新长出的叶片及果实中通过PCR扩增均能检测到TRV1/TRV2病毒存在;TRV-PDS沉默植株新长出叶片出现明显的光漂白现象,各沉默株系转录因子表达量的均显著性下降,说明TRV有效复制、转移,起到了良好的沉默效果。  沉默植株叶片类胡萝卜素总量均显著下降。其中,TRV-ABA处理的沉默植株效果最为突出,紫黄质下降了2.90倍,达0.57±0.06mg/g(DW);叶黄素下降了2.25倍,达3.85±0.22mg/g(DW),β-胡萝卜素、玉米黄质、番茄红素也分别下降了2.14、3.80、2.59倍;TRV-RAP和TRV-AGL沉默植株中玉米黄质和番茄红素也均发生显著性下降,有近6倍和3倍的差异。  沉默植株果实类胡萝卜素总量均上升。其中,TRV-ACO沉默植株果实中β-胡萝卜素发生显著性下降,达21.64±1.18μg/g(FW); TRV-RAP中番茄红素和γ-胡萝卜素与对照相比分别上升了1.90和2.53倍;TRV-ARG、TRV-DET、 TRV-ABA、TRV-GA沉默植株中γ-胡萝卜素也显著提高,与对照相比均提高了2倍以上。  利用LC-MS共检测到叶片中氨基酸6种,酚酸及类黄酮物质26种,其中含量最高的是α-番茄碱,达到13.54±2.91μg/g(DW)。利用MPP软件分析后发现沉默植株叶片中类黄酮与对照相比组成和含量上没有显著变化。  果实中检测到11种氨基酸,43种酚酸及类黄酮物质,比叶片中物质种类丰富。其中果实中含量最高的是香豆酸,达到22.26±1.77μg/g(DW)。利用MPP软件分析后发现沉默植株果实中类黄酮与对照相比均有物质呈倍性增减,如山奈酚3-O芸香糖苷、芦丁、α-番茄碱、咖啡酰丁二胺等。  利用GC-MS技术共检测到番茄果实挥发性物质38种,其中烯醛类占主要部分,含量最高的是经TRV-DET沉默后的3-己醛,达到了13.89±0.93μg/g(FW)。沉默果实中大部分挥发性物质都发生了显著性变化,如3-己醛、反式-2-己烯醛和α-蒎烯等。  因此,上述柑橘同源基因可能同时调控了番茄叶片和/或果实中萜类和其他的代谢途径。
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