杆状病毒表达载体系统是目前应用广泛的真核表达系统之一,它是一个以杆状病毒为外源基因载体,以昆虫细胞为受体的表达系统,其表达的蛋白在生物活性、翻译后修饰、结构和免疫活性等方面与天然蛋白质相似。为了在杆状病毒表达系统中最大程度地表达外源蛋白,需要对细胞接种密度、接种病毒量等参数进行优化,其中感染复数是尤为重要的一个参数。优化感染复数的前提是获得准确病毒的滴度,因此亟需建立一种稳定的杆状病毒滴度测定方法。GP64蛋白是杆状病毒的主要糖蛋白,在病毒感染期间,与细胞膜融合形成包膜融合蛋白,协助病毒融合到受感染的细胞膜上,从而完成病毒感染过程。本研究将感染细胞的杆状病毒表达的GP64蛋白作为靶蛋白,使用GP64单抗通过免疫染色测定重组杆状病毒滴度。本研究主要分为以下几个方面:1、杆状病毒GP64蛋白的表达及纯化构建含有GP64基因的真核表达质粒,转染中国仓鼠卵巢细胞,经过两次药物筛选后,Western blot鉴定选出表达量最高的细胞池。细胞池经过补料培养收获培养上清,通过His Trap FF亲和层析柱纯化蛋白。本研究共筛选到8种表达GP64蛋白的细胞池,选择表达量高的1B1-2细胞池进行补料培养,细胞培养上清纯化后获得GP64蛋白。2、GP64蛋白单抗的制备及鉴定纯化后GP64蛋白与野生型杆状病毒液分别作为免疫原免疫小鼠,通过间接酶联免疫吸附试验挑选出阳性杂交瘤细胞,其分泌的上清进行亚类鉴定。杂交瘤细胞制备腹水,经纯化后鉴定其特异性。本研究筛选到3株单抗5B1、2A12、5D1,亚类分别为IgG2b、IgG1、IgG1,轻链类型均为Kappa。纯化后的单抗进行间接免疫荧光试验和Western Blot分析,间接免疫荧光试验结果表明3株单抗均可以与杆状病毒发生特异性反应,Western Blot分析结果表明3株单抗均可以与GP64蛋白发生特异性结合。3、杆状病毒滴度测定方法的建立及应用GP64单抗作为一抗,通过免疫染色法筛选出最佳单抗,使用最佳单抗优化山羊血清、GP64单抗、HRP羊抗鼠二抗等参数后分别测定5种不同重组杆状病毒的滴度,同时使用商品化试剂盒进行测定,该方法与商品化试剂盒测定结果基本一致,表明初步建立了一种稳定的重组杆状病毒的滴度测定方法。综上试验:本研究通过中国仓鼠卵巢细胞表达系统得到8种表达GP64蛋白的细胞池,表达量较高的1B1-2细胞池通过补料培养、纯化得到GP64蛋白。纯化后的GP64蛋白和野生型杆状病毒分别免疫小鼠,通过间接ELISA筛选到3株GP64单抗。GP64单抗作为一抗,通过优化山羊血清、GP64单抗、HRP羊抗鼠二抗等参数后,同时测定5种不同重组病毒的滴度,测定结果与商品化试剂盒基本一致,表明初步建立了一种稳定的重组杆状病毒滴度测定方法,为重组杆状病毒表达外源蛋白的工艺参数提供了依据。