背景：肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)是包括移植肾相关疾病在内的各种肾脏病发展为终末期肾衰竭的共同病理路径。慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的病因主要包括原发性肾小球肾炎、高血压肾病、继发性肾小球肾炎、糖尿病肾病、肾小管间质病变、遗传性肾病等,在发达国家,糖尿病肾病和高血压肾病已成为CKD的主要原因,而在我国,上述两种疾病在各种病因中仍处于原发性肾小球肾炎之后,但近年也有明显增加趋势。近10余年以来,国际范围CKD的流行病学研究广受关注,在美国等发达国家的全国性调查显示,CKD是常见的慢性疾病,CKD在成年人群中患病率为10.2%-13.0%。在中国由王海燕教授牵头的“中国慢性肾脏病流行病学调查”采用多阶段分层抽样设计,获得能够代表中国成年人群的调查对象共计47204人,评价调查结果显示,中国18岁以上人群中CKD患病率为10.8%,据此估算,我国目前有CKD患者将达到1.2亿例。根据发达国家的统计数据,CKD患者中约有2%患者会进入终末期肾衰竭阶段,需要接受肾移植或者透析治疗来维持生命；按照每例尿毒症患者透析治疗花费10万元人民币/年计算,每年中国将为这些患者的透析支付2400亿元人民币。此外,CKD也与其他常见的慢性疾病之间存在复杂的交互作用,例如一项针对100万余人的随访研究结果表明,与肾功能正常者相比,肾功能轻中度下降者心血管病事件增加40%,死亡率增加20%,并且随着肾功能下降风险呈线性增加趋势。所以慢性肾脏病在中国已经成为最为严重的公共卫生问题之一。随着医学技术的发展,人体器官移植技术成为20世纪医学领域取得的重大进展之一,肾移植技术已成为目前治疗终末期肾病的最理想替代治疗方法,虽然移植肾的近期存活率已明显提高,但是晚期存活率并未相应升高,远期移植肾衰竭的最主要原因就是慢性移植肾肾病(chronic allograft nephropathy, CAN),常出现在移植后数月至数年,CAN的主要病理学变化包括肾间质纤维化和肾小管萎缩、肾小球硬化,在以上病理学改变中,肾小管萎缩和肾间质纤维化是影响移植肾远期预后的最关键因素。在移植肾病理诊断中,Banff2005已经删除了CAN这一概念,取而代之的是间质纤维化和肾小管萎缩(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA),并且引入了两个新的病理类型；慢性T细胞介导的排斥(chronic T-cell mediated rejection, CTMR)和慢性抗体介导的排斥(chronic antibody-mediated rejection, CAMR)。目前国内外对肾间质纤维化的发生发展做出了深入研究,尤其在肾间质纤维化的信号通路研究方面取得了瞩目的科研成果。大量研究证明转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad信号通路在器官纤维化的发展过程中起着主要作用,且有报告指出TGF-β1/Smad信号通路可能通过调控下游多种microRNA,从而控制上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)以及纤维化,从而影响各种器官纤维化的发展过程。MicroRNAs(miRNAs)是一类广泛存在于动植物基因组中的功能性非编码小分子RNA,大多由21至23个核苷酸构成,可通过与靶基因mRNA特定位点结合,诱导该mRNA降解或该蛋白合成而参与各种基因的表达和调控。在目前医疗技术水平阶段,慢性肾脏病以及肾移植后出现血肌酐升高、蛋白尿等表现时,组织穿刺活检仍是病因诊断的金标准,但是不论是原位肾脏穿刺还是移植肾穿刺,都要面临出血、感染等风险,目前国内关于]miRNA-21在肾脏纤维化机制中的作用报道较少,本实验通过测定miRNA-21在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstructive, UUO)大鼠间质纤维化肾脏组织和血浆中的表达,初步探讨其在TGF-β1/Smad3信号通路中的机制及意义,进而为寻找无创性检测肾间质纤维化特异性生物标记物提供一定理论依据。目的：(1)检测MicroRNA-21 (miRNA-21)在正常大鼠肾脏组织和血浆中的表达,并检测其在UUO大鼠间质纤维化肾脏组织和血浆中的表达,观察分析miRNA-21在两组中的表达差异。(2)初步探讨miRNA-21在TGF-β1/Smad3致大鼠肾间质纤维化信号通路中的机制。方法：(1)建立UUO大鼠模型：选择20只SD雄性大鼠,随机分为输尿管梗阻模型组(UUO组参和假手术组(Sham组),UUO组大鼠结扎左侧输尿管,Sham组只分离左侧输尿管而不结扎,别于建模后第3天、第7天各采集两组5只大鼠血液及肾脏组织进行相关检测。(2) miRNA-21检测应用实时荧光定量PCR (real-time qPCR)方法检测肾脏组织及血浆中miRNA-21的表达变化：UUO组和Sham组大鼠第3天及第7天肾脏组织RNA抽提按照Trizol试剂说明书进行,并使用紫外吸收对抽提出的RNA进行纯度和浓度检测,使用抽提出的肾脏组织RNA进行cDNA合成, 配备RT反应液后在PCR扩增仪进行RT反应,各样品的目的miRNA和内参(U6)分别进行Real-time qPCR反应,数据采用2-△△CT法进行分析,Sham组2-△△CT为1作为基准校正。血浆nicroRNA-21检测：使用TRI Reagent BD抽提血浆RNA,其余检测方法同上。(3)肾脏组织病理观察肾脏组织常规进行包埋及切片,采用HE、masson染色和免疫组化技术评价肾组织间质纤维化程度,使用免疫组化检测肾脏组织中TGF-β1、Smad3、I型胶原蛋白(collagen Ⅰ, Col-Ⅰ)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达情况。(4)统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学分析,组间计量资料数据以x±s表示,采用单因素方差分析,方差齐性组间比较采用LSD-t检验,若方差不齐采用Dunnett’s T3法,相关性分析采用Spearman法,P<0.05为差异有统计学意义。结果：(1)两组大鼠microRNA-21表达的变化建模后第3天和第7天UUO组肾脏组织和血浆中miRNA-21与Sham比较均升高(P均=0.000),7天UUO肾组织和血浆中miRNA-21与3天UUO相比升高(P=0.008和P=0.024),但血浆中miRNA-21表达水平不如肾脏组织明显。(2)两组大鼠肾脏组织病理学观察观察HE染色切片,Sham组肾单位大小、形态均未见异常,UUO组建模后3天见肾小管轻度扩张、小管上皮空泡样变,间质轻度水肿并散在炎性细胞,建模后7天即可观察到明显的肾间质增宽、胶原沉积增加、肾小管萎缩等,炎症细胞浸润明显,证明建模成功。观察masson染色大鼠肾脏组织,Sham组第3天和第7天masson染色无变化,肾单位及间质未见异常。UUO组建模后第3天,可见肾小管管腔轻度扩张,部分间质可见少量淡蓝色胶原组织沉积,UUO组建模后第7天,肾小管较3天模型组明显扩张,间质水肿增宽明显伴单核细胞及淋巴细胞广泛浸润,间质胶原纤维进行性增多、面积扩大、蓝染加重。3天UUO组、7天UUO组、3天Sham组和7天Sham组的masson染色胶原阳性面积评分组间比较有统计学差异(F=194.228,P=0.000),UUO组3天和7天肾脏组织纤维化程度评分明显高于同时期Sham组(P=0.000和P=0.000), UUO组7天纤维化面积与3天相比显著增多(P=0.000)。Sham组大鼠3天及7天肾脏组织中TGF-β1仅在肾小管上皮细胞中少量表达,间质中无表达,且各时间点无明显变化。与Sham组相比,UUO组3天、7天TGF-β1在肾小管上皮细胞和组织间质表达面积随时间逐渐增多,阳性染色逐渐加深。3天UUO组、7天UUO组、3天Sham组和7天Sham组的肾脏组织TGF-β1阳性面积组间存在显著差异(F=423.844,P=0.000),UUO组TGF-β1|阳性面积与同时期：Sham组比较统计学差异显著(P=0.000和P=0.000),UU07天TGF-β1阳性面积较UU03天组增多(P=0.000)。Sham组大鼠3天及7天肾脏组织中Smad3蛋白表达无明显变化,表达于少部分‘肾小管上皮细胞中。UUO组3天、7天Smad3与Sham组相比,在肾小管上皮细胞、组织间质表达面积明显增多,且强阳性表达于UUO组7天组织。3天UUO组、7天UUO组、3天Sham组和7天Sham组的肾脏组织Smad3阳性面积组间存在显著差异(F=768.544,P=0.000),两两比较UUO组Smad3阳性面积明显多于同时期Sham组(P=0.000和P=0.000),UU07天Smad3阳性面积多于UU03天(P=0.000)Sham组Col-Ⅰ在肾小管间质少量表达,与同时间Sham组比较,UUO组大鼠肾脏组织Col-Ⅰ蛋白表达面积明显增多,建模后时间越长,阳性面积表达越多。组间Col-Ⅰ表达面积具有明显统计学差异(F=1108.079,P=0.000),各组间两两比较,UUO组Col-Ⅰ阳性面积多于同时期Sham组(P=0.000),UU07天Col-Ⅰ阳性面积多于UU03天(P=0.000)。α-SMA在Sham组阳性面积较少,UUO组α-SMA在肾组织间质中表达面积随建模后时间延长增多,7天阳性染色最深。组间α-SMA表达面积具有明显统计学差异(F=292.363,P=0.000),各组间两两比较,UUO组α-SMA阳性面积多于同时期Sham组(P=0.000),UU07天α-SMA阳性面积明显较UU03天增多(P=0.000)。(3) MicroRNA-21与组织纤维化相关性分析UUO组肾组织和血浆中miRNA-21的表达与肾间质纤维化评分正相关(r=0.816、r=0.907,P均=0.000)；肾组织miRNA-21与TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达呈正相关(r=0.79、r=0.849、r=0.888、r=0.882, P均=0.000)；血浆miRNA-21与TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达呈正相关(r=0.816、r=0.875、r=0.904、r=0.905, P均=0.000)。结论：(1)UUO大鼠肾组织和血浆中microRNA-21在建模后表达上调,且间质纤维化程度越重表达越高。(2) TGF-β1/Smad3信号通路可能是促进下游,microRNA-21表达上调,从而介导大鼠肾间质纤维化。