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研究意义结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的世界第二大传染病。我国是结核病高流行国家,且新发病例数远高于国际平均水平,结核病的防控面临着严峻挑战[1-2]。MTB的细胞壁很厚,其中含有大量脂质,能阻碍药物通过细胞壁间隙进入菌体内,导致多种抗生素对其天然耐药[3-4]。这也是临床上治疗效果不显著、治疗周期长、耐药菌株不断增多的原因。聚乳酸羟基乙酸[poly(Plactic-co-glycolic acid),PLGA]是由乳酸和羟基乙酸聚合而成的高分子材料,其具有生物相容性、可降解性等多种特性,现已被广泛的应用于生物医学领域[5],且超声联合载药微泡在抗感染等方面已展示出良好的前景。耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,MS)具有相似于MTB遗传学特性,没有生物危害性,故本文选用MS作为研究对象。我们选用抗结核药物左氧氟沙星,制备载左氧氟沙星PLGA纳米粒,并联合低频低强度超声(Low-frequency and Low-intensity,LFLIU)体外辐照MS菌悬液,探究其协同杀菌的作用,有望为研究超声联合载药PLGA纳米粒治疗结核病奠定基础。目的针对抗酸杆菌细胞壁结构的特殊性,探究LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌效果,有望为临床上抗结核治疗提供一种新的治疗方法。方法1.载左氧氟沙星PLGA纳米粒的制备及特性比较:采用双乳化法制备3种PLGA纳米粒,即载左氧氟沙星PLGA纳米粒、空PLGA纳米粒、载绿色荧光葡聚糖PLGA纳米粒。(1)光镜与电镜下观察PLGA纳米粒的形态,马尔文激光粒度仪检测PLGA纳米粒的粒径与电位;(2)激光共聚焦显微镜观察载绿色荧光葡聚糖纳米粒荧光包裹情况;(3)分光光度计检测载左氧氟沙星PLGA纳米粒12h内药物的自动缓释效率;(4)分光光度计检测载左氧氟沙星PLGA纳米粒在0.15W/cm2、0.3W/cm2超声剂量下10min内药物释放的效率。2.不同超声剂量和辐照时间以及不同药物浓度对MS的协同杀菌效果研究:选用频率为42KHz,声强0.15-0.6W/cm2连续可调,换能器直径为1.5cm的LILFU设备。(1)检测左氧氟沙星对MS的最小抑菌浓度,以参考确定实验用药浓度,(2)超声强度与辐照时间分别为:0.15W/cm2,5min。用0.125μg/ml、0.25μg/ml(同纳米粒内药物浓度)左氧氟沙星及载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LILFU协同杀菌,培养36h用平板菌落计数法计算细菌活力,评价超声联合不同浓度载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌作用。(3)超声辐照时间5min,药物浓度选择0.125μg/ml、0.25μg/ml。用不同超声强度0.15W/cm2、0.3W/cm2LILFU联合左氧氟沙星及载左氧氟沙星PLGA纳米粒协同杀菌,培养36h用平板菌落计数法计算细菌活力,评价不同强度超声联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌作用。(4)超声强度0.15W/cm2,药物浓度选择0.125μg/ml、0.25μg/ml。在不同辐照时间5min、10min,用LILFU联合左氧氟沙星及载左氧氟沙星PLGA纳米粒协同杀菌,培养36h用平板菌落计数法计算细菌活力,评价不同辐照时间LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌效果。结果1.3种PLGA纳米粒物理特性及释放效率:(1)光镜及电镜下显示,3种PLGA纳米粒大小均匀、呈球形,分散度良好。马尔文激光粒度仪检测载左氧氟沙星PLGA纳米粒粒径为282.5?2.5nm,表面电荷为-18.5?0.8。激光共聚焦显微镜下可见载绿色荧光葡聚糖PLGA纳米粒发出绿色荧光,表明绿色荧光葡聚糖成功载入PLGA纳米粒。(2)载左氧氟沙星PLGA纳米粒的载药率及包封率分别为1.04%,21.40%,但载绿色荧光葡聚糖PLGA纳米粒的载药率高于载左氧氟沙星PLGA纳米粒,为2.70%,可能与不同物质的极性有关。(3)载左氧氟沙星PLGA纳米粒12h内药物释放率结果显示,在最初2h为突释过程,累计释放率为22.87%,经过8h后,药物释放趋于平稳,到达12h后,释放药物的量占总量的57.64%。(4)当LILFU辐照载左氧氟沙星PLGA纳米粒后,其药物释放率明显提高。当LILFU声强为0.15W/cm2、0.3W/cm2辐照10min后,药物释放量短时间内达到50%以上,两者辐照10min释放率差异不大,可见LILFU可促进纳米粒破裂,提高药物释放率。2.LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒具有协同抗菌作用:(1)左氧氟沙星对MS的最小抑菌浓度为0.25μg/ml。(2)当超声声强与辐照时间相同条件下,不同浓度药物及载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU对耻垢分枝杆菌的杀菌效果显示,杀菌效果会随着药物浓度升高而越好。而超声联合药物组杀菌效果优于游离药物组,而载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU组杀菌效果优于LFLIU联合游离药物组,载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU组杀菌效果显著,其中0.25μg/ml载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU的细菌存活率为42.56%,与其他组相比最低。(3)在不同超声声强下,声强越高,杀菌效果越明显。超声联合药物组杀菌效果优于单独超声组,而载左氧氟沙星PLGA纳米粒组杀菌效果优于药物组。当声强为0.3W/cm2时,LFLIU联合载左氧氟沙星纳米粒组细菌存活率最低,为35.26%。(4)在超声辐照不同时间下,随着超声辐照时间延长,载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU杀菌效果越明显,较其他组细菌存活率最低为39.21%。结论1.本实验采用双乳化法成功制备了形态大小均一、包封率较高且生物毒性低的载左氧氟沙星PLGA纳米粒。2.载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU辐照对MS具有高效协同杀菌作用。