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研究背景腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)由于具有操作简单、血流动力学稳定和有利于保护残肾功能等优点,因此被广泛运用于终末期肾脏疾病(end stage renal disease, ESRD)患者的治疗,然而PD的相关并发症影响着ESRD患者的治疗效果和预后,其中透析相关性腹膜纤维化(peritoneal fibrosis,PF)导致的超滤衰竭(ultrafiltration failure,UFF)是持续性非卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD)患者不能持续治疗的主要原因。转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β)和高糖介导的PF发病机制一直是国内外PD领域研究的热点,有研究发现,上皮细胞-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腹膜纤维化发生的过程中起着关键的作用,它被认为是腹膜纤维化的起始环节和可逆阶段。微小RNA (microRNA, miRNA, miR)是广泛存在于真核生物细胞中长度为21-24个核苷酸的非编码小分子RNA,其通过“种子”序列与靶基因mRNA3’端非翻译区(untranslated region,UTR)特异性结合,导致蛋白翻译受到抑制或靶mRNA降解,从而影响调节转录后的基因表达,在多种生理过程中发挥重要作用。miRNA-200家族是近年来研究的热点,尤其miRNA-200家族与EMT密切相关,miRNA-200通过调控EMT过程,对胚胎的发育、肿瘤的侵袭转移及器官纤维化均起着重要作用。尽管miRNA-200c在腹膜间皮细胞上是否有表达以及其在腹膜间皮细胞EMT和腹膜纤维化中的作用国内外尚未见报道。但基于以上分析,我们认为,microRNA-200c可能参与了调控腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化的过程,并且调节miRNA-200c的表达水平可能影响腹膜间皮细胞的EMT过程。第一章腹膜透析患者腹膜透析流出液细胞中microRNA-200c的表达及与转分化的关系目的：检测腹膜透析患者腹膜透析流出液细胞中microRNA-200c的表达及EMT发生情况,初步探讨microRNA-200c与腹膜间皮细胞EMT的关系。方法：随机选取新开管CAPD患者13人,PD时间≥1年者14人,分离培养并鉴定流出液细胞；通过realtime PCR检测流出液细胞中microRNA-200c的表达；利用realtime PCR及western blot分别检测流出液细胞中E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、胶原蛋白I(Collagen-I, Col-I)的mRNA及蛋白表达。并对microRNA-200c与E-cadherin、vimentin、FN、Col-1进行相关性分析。结果：腹透流出液细胞为人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells, HPMC),不同透龄患者流出液细胞存在形态学改变。microRNA-200c在PD≥1年组中的表达较新开管组明显下降。PD≥1年组流出液细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达明显低于新开管组,而vimentin、Col-1及FN mRNA及蛋白表达明显高于新开管组。且microRNA-200c与E-cadherin呈正相关,与vimentin、FN、Col-I呈负相关。结论：腹膜透析患者腹透流出液细胞经证实为人HPMC,并表达microRNA-200c;随PD时间的延长,microRNA-200c表达呈显著降低并同时伴有EMT的发生和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积,提示nicroRNA-200c可能与腹膜纤维化有关。第二章microRNA-200c在高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT中的作用目的：探讨microRNA-200c在高糖诱导的人腹膜间皮细胞株(HMrSV5) EMT中的作用。方法：以含5.6mM葡萄糖的普通培养基作为对照组,HMrSV5细胞被给予不同浓度(30,60,90mM D-葡萄糖)高糖刺激,刺激时间为24小时,通过realtime PCR检测]HMrSV5细胞microRNA-200c的表达；利用realtime PCR及western blot分别检测]HMrSV5细胞中E-cadherin、Col-I、vimentin、FN mRNA及蛋白的表达。在不同时间点(0h,12h,24h,48h)用90mmM D-葡萄糖处理HMrSV5细胞后,通过realtime PCR检测]HMrSV5细胞microRNA-200c的表达；通过realtime PCR及western blot分别检测HMrSV5细胞中E-cadherin、Col-I、 vimentin、FN mRNA及蛋白的表达。转染microRNA-200c的模拟物(mimics)及阴性对照miR-200c mimics negative control,再予高糖刺激,通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测HMrSV5细胞E-cadherin、Col-I、vimentin、FN的表达变化。结果：与正常对照组相比较,高糖抑制]HMrSV5细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达水平,且呈时间及浓度依赖性；同时高糖促进vimentin\FN及Col-I mRNA及蛋白表达水平,也呈时间及浓度依赖性。与正常对照组比较,高糖抑制HMrSV5细胞microRNA-200c表达,呈时间及浓度依赖性。过表达microRNA-200c可以使高糖刺激组E-cadherin mRNA和蛋白表达上调,vimentin、Col-I、FN mRNA和蛋白表达下调；但转染miR-200c mimics negative control后对高糖诱导的HMrSV5细胞E-cadherin、Col-I、vimentin、FN的表达变化无明显影响。结论：高糖诱导HMrSV5细胞发生EMT；高糖诱导HMrSV5细胞microRNA-200c表达下调；上调microRNA-200c可逆转HMrSV5细胞EMT,提示microRNA-200c抑制高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT。第三章microRNA-200c通过调节ZEB1参与高糖诱导的人腹膜间皮细胞转分化目的：阐明microRNA-200c参与调控高糖诱导的HMrSV5细胞EMT的可能机制,为靶向microRNA-200c防治腹膜纤维化提供理论依据。方法：采用realtime PCR及western blot检测不同透析时间PD患者腹膜透析流出液分离培养的HPMC中ZEB1mRNA及蛋白的表达；用不同浓度(30,60,90mM D-葡萄糖)高糖及在不同时间点(Oh,12h,24h,48h)用90mM D-葡萄糖刺激HMrSV5细胞后,通过realtime PCR及western blot检测]HMrSV5细胞中ZEB1的表达；转染microRNA-200c mimics及miR-200c mimics negative control后,通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测高糖刺激下HMrSV5细胞ZEB1mRNA及蛋白表达变化。结果：PD≥1年组与新开管组比较,腹膜透析流出液分离培养的HMPC中ZEB1的表达增高；与正常对照组比较,高糖促进HMrSV5细胞ZEB1mRNA及蛋白表达,且呈时间和浓度依赖性上调。过表达microRNA-200c可以使ZEB1mRNA和蛋白水平下调；转染miR-200c mimics negative control后对高糖诱导的HMrSV5细胞ZEB1的表达变化无明显影响。结论：长期PD患者腹透流出液分离培养的HPMC ZEB1表达上调；高糖促进HMrSV5细胞ZEB1mRNA及蛋白表达,miRNA-200c过表达抑制高糖组HMrSV5细胞中ZEB1的表达,提示miRNA-200c通过转录后水平调节ZEB1,影响E-cadherin等的表达,从而参与高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT。