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核酸损伤AlkB修复酶通过氧化去甲基方式修复1-甲基腺嘌呤和3-甲基胞嘧啶损伤，其中包括大肠杆菌AlkB和人体内的AlkB同源蛋白ALKBH2和ALKBH3。一方面，AlkB修复酶通过其修复酶活性维持了基因组完整度，保障遗传信息的正确传递;另一方面ALKBH2和ALKBH3被证明与细胞烷基化耐受、肿瘤发生发展等过程密切相关。目前，AlkB和ALKBH3已经有抑制剂报道，但是由于缺乏系统的靶标验证研究，因而均不能作为化学工具应用在化学生物学研究中。 我用已知FTO的活性抑制剂大黄酸(rhein)作为化学工具，进行了大黄酸抑制大肠杆菌AlkB的靶标验证研究。首先在酶学水平上发现大黄酸可以有效抑制AlkB修复酶活性，IC50为12.7μM。表型试验发现，在大黄酸(100μg/ml)和甲磺酸甲酯(MMS，75μM)单独处理不产生大肠杆菌增殖毒性的剂量下，二者联合使用显著抑制了大肠杆菌增殖，表明大黄酸使得大肠杆菌对于烷基化试剂MMS更加敏感。DNA点印记分析表明，MMS在细菌基因组上产生了AlkB底物3-甲基胞嘧啶损伤，而大黄酸浓度依赖性地加剧了由MMS引起的损伤累积，可能是导致增敏表型的直接原因。在这一过程中，大黄酸没有改变AlkB蛋白的丰度，可能是抑制了AlkB的修复酶活性，从而引起了损伤累积。经过遗传学手段证明，大黄酸和MMS产生的协同抑菌表型依赖于细菌内AlkB蛋白的丰度和活性。胞内热迁移试验发现大黄酸在细胞质环境中提高了AlkB的热稳定性，表明大黄酸在细菌中直接靶向AlkB。选择性分析发现，大黄酸在50倍过量浓度时仍未抑制甲基转移酶和DNA糖苷化酶的活性，在主要三种DNA甲基化损伤修复途径中选择性抑制AlkB修复途径。大黄酸不与SN1型烷化剂和氧化剂产生协同表型。等温量热滴定(ITC)发现大黄酸结合AlkB-Mn2+复合物的Kd值为0.29μM，差异荧光扫描(DSF)试验中20倍过量浓度的大黄酸使AlkB的热变性温度提高了8度以上，表明大黄酸和AlkB结合活性较强，并提高了AlkB的热稳定性。AlkB-大黄酸复合物晶体结构揭示了抑制机理，大黄酸是α-酮戊二酸(2OG)竞争性抑制剂。虽然AlkB和FTO的活性口袋相似，但大黄酸在二者口袋中的结合位点并不相同。以上试验描绘了大黄酸抑制AlkB的菌内可溯性和抑制机理，大黄酸作为化学工具可以表征AlkB修复酶活性和细菌烷基化抵抗之间的关系。 利用大黄酸作为化学工具进一步探究了人源ALKBH2和ALKBH3被小分子抑制后对细胞的影响。大黄酸在生化水平有效抑制ALKBH修复酶，IC50分别为9.1μM(ALKBH2)和5.3μM(ALKBH3)。DSF试验发现大黄酸也提高了ALKBH修复酶的热稳定性。大黄酸(80μM)和MMS(250μM)均未产生U87细胞增殖毒性，二者联合使用导致U87细胞完全死亡，表明大黄酸和MMS协同抑制U87的增殖。基因沉默ALKBH2和ALKBH3破坏了大黄酸和MMS的协同表型，表明ALKBH修复酶是协同作用的靶标。大黄酸不与包括替莫唑胺在内的SN1型烷化剂协同抑制U87细胞的增殖。蛋白免疫印迹分析表明JMJD家族酶活性被抑制不是导致大黄酸和MMS协同作用的原因。 所有结果均指向AlkB修复酶是大黄酸和MMS协同效应的靶标。我首次报道了具有细胞可溯性的AlkB修复酶抑制剂，证明ALKBH修复酶在抗肿瘤化疗联合用药策略中具有潜在的靶标价值。