研究背景及目的：　　缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke ，CIS) ，又称脑梗死(cerebral infarction，CI)，是指向大脑供应血液的血管受到阻塞，引起脑部血液循环障碍，脑组织缺血、缺氧，继而软化坏死。它是最常见的一类脑血管病，约占所有脑卒中发病比例 80%。2008 年卫生部公布的第三次全国死因调查表明，脑血管病（136.64/10万）已超过恶性肿瘤（135.88/10万）成为我国居民第一致死病因[1]。脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率及经济负担重的特点。目前针对急性期神经保护治疗的不足，提出了在相当长的一个时间内进行神经恢复性治疗（neurorestorative events）[2]。这种神经恢复性治疗既包括神经发生、突出可塑性改善，也包括脑部血管新生。因此，促进血管新生成为治疗CIS的新策略。　　2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（2,3,5,4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG；中文化学名简称为二苯乙烯苷），是一个天然多羟基化学单体，具有非常强的抗氧化作用。近年来，研究表明 THSG在某些神经退行性疾病方面具有一定的脑保护作用，延缓衰老，体内实验证实可改善或提高记忆[3]。此外，THSG对血管内皮具有一定的保护作用。这与其抗氧化、抗炎、抗血小板凝集有关[4-6]。　　本课题针对 THSG 在缺血再灌注损伤后血管新生及其调控机制进行了研究。首先，从体内实验入手再次确认了 THSG在本次实验条件下对大鼠脑组织缺血再灌注损伤的保护作用；其次，阐明了这种保护作用在缺血再灌注损伤早期与其抗炎抗氧化功效有关；最后又从体内、体外两方面考察损伤后脑组织血管内皮的变化以及 THSG对损伤后脑组织血管新生的作用及其机制。研究结果为 THSG治疗和保护缺血再灌注损伤的新药研发提供实验依据。　　研究方法：　　在体实验，采用大脑中动脉栓塞法（ middle cerebral artery oclusion ，MCAO）诱导大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，建立动物模型；给予动物不同剂量的THSG（30 mg/kg、60 mg/kg、120mg/kg）或阳性药尼莫地平腹腔注射治疗；采用改良的神经行为学评分（modified Neurological Severity Scores, mNSS）方 法 评 价 动 物 神 经 行 为 学 改 变 ； 运 用 2,3,5-三 苯 基 氯 化 四 氮 唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色评价脑梗死率；伊文斯兰（evans blue, EB）染色评价脑血管通透性；试剂盒检测组织内丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性、血清总胆固醇（totoal cholesterol, TC）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）含量；免疫印迹（Western blotting）法研究组织内炎性因子，如肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor, TNF-α）、白介素-1β（ interleukine-1β，IL-1β）和白介素-10（interleukine-10，IL-10）等的表达；以CD31为内皮细胞标志物，通过免疫荧光技术评价缺血半暗区的毛细血管密度；采用ELISA方法检测血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量；免疫组化和免疫印迹（ Western blotting ）方法评价组织内VEGF、血管生成因子1（angiopoietin 1，Ang 1）及其受体（angiopoietin receptor 2，Tie 2）的表达。　　体外细胞实验中，建立人脑微血管内皮细胞 hCEMC/d3的氧-糖剥夺复氧(oxygen-glucose deprivation reoxygenation，OGD/Reox)模型。采用 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）和CCK-8法测定细胞活性；酶标仪检测乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）释放；通过管腔形成实验和划痕实验考察 THSG 对 hCEMC/d3 细胞在缺氧复氧后的管腔形成及迁移能力的影响；采用实时定量PCR（real-time PCR）和Western blotting技术检测基因表达。　　研究结果：　　1、THSG对 MCAO诱导的大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织的保护作用　　MCAO诱导的大鼠缺血再灌注损伤后连续腹腔注射给予 120 mg/kg THSG 14天，与模型组相比能降低神经行为学评分，可改善大鼠异常神经行为（ P<0.05或 P<0.01）；MCAO诱导的大鼠缺血再灌注损伤后，采用 30 mg/kg、60 mg/kg、120mg/kg THSG腹腔注射 3天、7天和 14天，中、高剂量 THSG（60 mg/kg和 120 mg/kg）均可减少大鼠脑组织梗死体积（P<0.05或 P<0.01），且呈时间、剂量依赖效应；THSG给药组可减少 MCAO导致梗死侧脑组织中 EB含量的上调，维持MCAO后动物血脑屏障的完整性。　　2、THSG 对 MCAO 诱导大鼠脑损伤氧化应激、血脂异常和炎性反应的作用　　中、高剂量THSG（60 mg/kg和 120 mg/kg）能够抑制 MDA的生成，升高 SOD、GSH-Px活性，且与模型组比较具有显著性差异（P<0.05或 P<0.01）；中剂量THSG在术后 14天可降低血清 TC，提高血清 HDL水平（P<0.05）；高剂量THSG在术后 7天、14天降低血清 TC含量，升高血清 HDL水平，该作用在14天表现更为明显（P<0.01）；THSG可抑制模型动物 TNF-α和 IL-1β表达水平的上调，且该作用呈剂量依赖性（P<0.01）。中高剂量 THSG可以使 IL-10蛋白分子表达水平显著上调，与模型组比较，具有显著差异（ P<0.01）。　　3、THSG对 MCAO诱导的大鼠脑组织损伤后血管新生的作用　　120 mg/kg THSG连续给药第 14天，可增加大鼠脑梗死灶周边缺血半暗区的微血管密度（P<0.01）；THSG 在缺血再灌注损伤后的急性期和非急性期均可促进血清 VEGF表达（P<0.05）；THSG可上调缺血核心区和缺血半暗区内的 VEGF、Ang 1、Tie 2蛋白的表达，与模型组比较具有显著性差异（ P<0.01）。　　4、THSG对 OGD/Reox损伤人脑血管内皮细胞的保护作用及机制　　10 μM-100 μM THSG可增加hCMEC/d3细胞在复氧过程中的细胞活力，提高损伤细胞的存活率（P<0.05或P<0.01）；50 μM、100 μM THSG处理均可增加hCMEC/d3细胞在 OGD/Reox过程中管腔样物质的形成，与模型组比较其长度显著增长、迁移能力增强（ P<0.01），其划痕区的相对距离与模型组比较明显减少（ P<0.01 ），可代偿性增加 hCMEC/d3 细胞在 OGD/Reox 过程中HIF-1α、VEGF、GLUT-1 的 mRNA 水平（P<0.01），并上调 hCMEC/d3 细胞在 OGD/Reox过程HIF-1α、VEGF、Ang 1/Tie 2、PI3K、p-AKT和 mTOR蛋白的表达（P<0.01）。　　研究结论：　　1、THSG对局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用。　　2、THSG缓解 MCAO诱导的大鼠脑缺血再灌注损伤产生的氧化应激、血脂异常和炎性反应。　　3、THSG 显著增加大鼠脑梗死灶周边缺血半暗区的微血管密度，具有促进缺血再灌注损伤脑组织微血管新生作用。　　4、THSG对 OGD诱导人脑血管内皮细胞损伤具有保护作用，并可促使内皮细胞迁移，增加官腔样物质形成；其作用机制可能与其介导PI3K-AKT-mTOR信号通路，上调 VEGF、Ang-1、Tie 2的表达相关。