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ClpP蛋白酶在原核和真核细胞中广泛存在,发挥重要的生理功能。ClpP的功能主要包括参与细胞内蛋白质量控制以维持细胞内蛋白稳定和调节细胞发育这两个方面。在模式细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中,ClpP蛋白酶参与该细菌的生长、芽孢产生和生物膜形成等重要生理过程。该蛋白在蜡样芽孢杆菌(B.cereus)中的功能尚缺乏深入研究。利用根际微生物控制植物病害是植物病害综合治理的重要组成部分。生防微生物在自然环境的稳定存在是其发挥生防作用的前提。蜡样芽孢杆菌0-9是一株从健康小麦根部分离获得的一株生防菌株,对小麦纹枯病具有防治效果。研究蜡样芽孢杆菌的生物膜形成和芽孢产生等分子机制,揭示其环境适应性,有助于提高生物防治效果。通过生物信息学分析B.cereus 0-9的基因组序列,发现在0-9基因组中存在2个枯草芽孢杆菌clpP基因的同源基因,分别命名为:clpP1,clpP2。在实验室前期构建的?clpP1,?clpP2单敲除菌株的基础上,利用基因同源重组构建clpP1和clpP2的双敲除菌株?clpP1?clpP2。通过测定不同基因敲除菌株的表型,结果显示,与野生型菌株0-9相比,ΔclpP1和ΔclpP2在菌落形态、生物膜形成、生长、产蛋白酶和低温敏感性等方面无明显差异,而ΔclpP1ΔclpP2的上述表型均存在缺陷。暗示clpP1和clpP2在决定上述表型方面存在功能冗余,只有二者同时缺失时,才表现出明显的生理学效应。测定不同菌株的运动性、低温和高温敏感性等表型,发现ΔclpP1与野生型菌株无明显差异,而ΔclpP2,ΔclpP1ΔclpP2与野生型菌株差异明显。表明在细菌的运动性和高温敏感性方面,clpP2基因发挥主导作用。测定不同菌株对于氨苄青霉素的敏感性,发现ΔclpP1和ΔclpP1ΔclpP2对氨苄青霉素敏感,暗示clpP1可能参与维持细菌细胞壁的正常生理功能。上述结果表明,蜡样芽孢杆菌中存在的两个clpP基因,对于菌落形态、生长、产孢和胁迫耐受性等多方面发挥不同的作用。为进一步探索clpP基因参与生物膜形成、芽孢产生和运动性的作用机制,分析B.cereus 0-9基因组序列,发现存在两个spx相关基因,命名为spx1和spx2。鉴于spx基因在枯草芽孢杆菌细胞中积累影响芽孢产生和生物膜形成,在双敲除菌株ΔclpP1ΔclpP2的基础上顺序敲除spx1和spx2基因,构建三基因敲除菌株和四基因敲除菌株并测定表型。结果显示ΔclpP1ΔclpP2Δspx1三敲除菌株和ΔclpP1ΔclpP2Δspx1Δspx2四敲除菌株均能恢复菌落形态、芽孢产生和运动性至0-9野生型菌株水平,而三敲除菌株ΔclpP1ΔclpP2Δspx2不能恢复表型。暗示clpP1和clpP2双基因缺失后出现的表型缺陷可能是由于spx1基因过量表达造成的。分别原核表达Spx1和Spx2蛋白并制备两个蛋白的多克隆抗体,蛋白免疫印迹测定Spx1和Spx2在ΔclpP1ΔclpP2中的积累情况,结果显示clpP1,clpP2基因的缺失确实造成细胞内Spx1和Spx2蛋白的积累。上述结果表明,蜡样芽孢杆菌0-9中clpP1和clpP2基因缺失后,造成Spx1蛋白积累进而出现菌落形态、芽孢产生和生物膜形成等表型的改变。为了探索spx在蜡样芽孢杆菌中的生理作用,通过测定spx缺陷型菌株的生物学性状,发现Δspx1,Δspx2均表现出对二酰胺和过氧化氢的耐受性,而Δspx1Δspx2对二酰胺和过氧化氢的耐受性更为敏感。表明spx基因主要参与维持细胞氧化还原平衡。本研究通过构建ΔclpX(GFP-ssrA),0-9(GFP-ssrA)标记菌株,通过测定标记菌株在对数期以及稳定期的绿色荧光电子激发量并利用蛋白免疫印迹测定GFP-ssrA的表达量,发现ΔclpX(GFP-ssrA)中GFP的表达量显著高于野生型菌株0-9菌株的表达。通过RT-qPCR测定ΔclpX(GFP-ssrA),0-9(GFP-ssrA)中GFP-ssrA转录水平的量,发现无显著差异。表明ClpXP蛋白水解复合物可以对异常蛋白GFP-ssrA进行特异性降解,ClpXP直接降解GFP-ssrA异常蛋白,不影响蛋白的合成过程。