研究背景:心肌肥厚是心脏对多种病理性刺激,如高血压,缺血性心脏病,瓣膜缺陷等引起压力负荷升高的一种代偿性反应。这种反应早期通过增加心脏收缩力有利于维持心功能。然而,持续的压力负荷,导致体内多种神经体液因子激活,这些神经体液因子最终会导致心肌损伤,心功能恶化,促进心脏衰竭的发生发展,严重威胁人类健康。然而心肌肥厚的发病机制目前尚不十分明确,并缺乏有效的治疗措施。因此,探索心肌肥厚的发生机制及其防治措施是心血管领域研究的热点问题。β肾上腺素能受体(β-AR)家族在心血管系统中发挥了重要的调节作用。近年来研究发现除了传统的β1/β2-AR之外,心脏还存在β3-AR。与β1/β2-AR相反,β3-AR的激活抑制心肌收缩力。已经在人体和动物模型中证实,心衰时β3-AR表达增加。然而β3-AR的增加在心衰中到底扮演了何种角色,是对儿茶酚胺浓度过高的代偿性保护反应还是心衰的促进因子目前尚不清楚。最新研究发现,一氧化氮合酶(NOS)解耦联是导致NO水平下降和活性氧(ROS)水平升高的重要机制,是高血压、糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖、动脉粥样硬化、心力衰竭等疾病中发生的重要原因,纠正NOS解耦联有望为保护心血管系统提供有效途径。NOS解耦联是否参与了β3-AR对心脏的调控作用,目前尚未见报道。研究目的:本研究通过观察β3-AR基因敲除小鼠(β3-/-)压力负荷下心脏结构和功能的变化,以及压力负荷时给予野生型(WT)小鼠β3-AR激动剂治疗后心脏结构和功能的变化,从正反两方面研究β3-AR信号转导通路对压力负荷时心脏的调控作用,探讨NOS解耦联在β3-AR调节心脏功能中的作用,旨在阐明β3-AR通过调控NOS偶联发挥心脏保护作用,为心肌肥厚,心力衰竭的防治提供新的理论依据和治疗措施。研究方法:本研究通过结扎小鼠主动脉弓建立压力负荷心肌肥厚模型,采用心脏超声、组织学方法及多种分子生物学技术,(1)比较β3-AR基因敲除小鼠和野生型小鼠给予慢性压力负荷后,心脏结构和功能、NOS活性及蛋白表达,活性氧及BH4水平的变化。(2)观察给予β3-AR基因敲除小鼠BH4补充性治疗,对压力负荷所致心肌肥厚,心功能和活性氧的改变。(3)观察给予压力负荷野生型小鼠β3-AR激动剂BRL 37344治疗,心脏结构和功能,NOS活性及蛋白表达,活性氧水平的变化。研究结果:(1)8周大FVBβ3-/-小鼠体重,室壁厚度及超声测算的左室重量较FVB WT小鼠轻度增加,而心率,左室腔内径及收缩功能两组间没有统计学差别。14-18月时WT小鼠表现为轻度心肌肥厚(P<0.05 vs. 8周),而β3-/-小鼠则有明显的左室肥厚,其室壁厚度(1.30±0.14 vs. 0.86±0.07 mm, P<0.001)和左室重量(196±12 vs. 129±20 mg, P<0.05)均较WT小鼠显著增加。(2)分别给予β3-/-和WT小鼠轻度主动脉缩窄术(25G TAC)和假手术(sham)后,β3-/-小鼠TAC 9周后存活率较WT小鼠明显下降(38%vs. 85%,χ2=10.78, P<0.001)。(3)TAC 9周后,β3-/-小鼠较WT小鼠发生更为严重的心肌肥厚和心脏重构,表现为进一步增加的心脏重量/胫骨长度比值(HW/TL 175.2±17.8 vs. 123.3±4.0, P<0.01),心肌细胞直径(39.3±0.9 vs. 31.3±0.9μm, P<0.001)和心肌纤维化程度(2.7±0.3 vs. 1.2±0.1, P<0.05 vs. WT/TAC for all)。(4)心脏超声结果显示WT小鼠TAC后,LVEDD, LVESD和小轴缩短率与假手术组比较无明显变化,而β3-/-小鼠TAC后,LVEDD(3.90±0.26 vs. 2.91±0.04 mm, P<0.001)和LVESD(2.47±0.36 vs. 1.02±0.05 mm, P<0.001)较假手术组明显增加,小轴缩短率显著降低(38.2±5.0 vs. 64.9±1.8%, P<0.001)。(5)WT小鼠和β3-/-小鼠TAC后,室壁厚度(1.30±0.02 vs. 0.83±0.01 mm, P<0.001)明显增加,但β3-/-小鼠较WT小鼠的室壁厚度(1.43±0.03 vs. 1.02±0.03 mm, P<0.001 vs.β3-/-/sham; P<0.01 vs. WT/TAC)增加更多。(6)基础状态下β3-/-和WT小鼠心脏NOS活性无区别(26.9±0.4 vs. 27.6±0.4 A.U., P=NS)。TAC 9周后,WT小鼠NOS活性较sham组无明显变化(27.7±0.3 A.U., P=NS vs. WT/sham),而β3-/-小鼠心脏NOS活性较β3-/-/sham组明显下降(19.3±1.2 A.U., P<0.001 vs.β3-/-/sham)。(7)基础状态下,β3-/-和WT小鼠心脏超氧化物活性无差别(1145±146 vs. 1106±109 cpm/mg,P=NS)。TAC 9周后,WT和β3-/-小鼠心脏总O2-活性均较sham组增加,差异有统计学意义,但β3-/-小鼠O2-活性较WT小鼠升高近60% (2730±121 vs. 1719±52 cpm/mg,P<0.05 vs. sham, P<0.001 vs. WT/TAC)。(8)基础状态下β3-/-和WT小鼠心脏NOS依赖的O2-活性无差别(P=NS)。TAC 9周后,WT小鼠NOS依赖的O2-活性较sham组增加不到1倍,而β3-/-小鼠TAC 9周后NOS依赖的O2-活性较sham组升高2倍多,并且较WT/TAC小鼠进一步增加(P<0.01,β3-/-/TAC vs. WT/TAC)。(9)基础状态下β3-/-和WT小鼠心脏GTPCH-1的蛋白表达水平无区别。TAC 9周后,WT小鼠较sham组心脏GTPCH-1的蛋白表达水平无明显变化。而β3-/-小鼠TAC 9周后心肌GTPCH-1的蛋白表达量较sham组明显下降(P<0.05 vs.β3-/-/sham)。(10)各组间心肌组织BH4含量无明显变化,β3-/-小鼠TAC后BH4含量略有增高(35.6±1.9 vs. 27.0±0.9 pmol/mg protein,P<0.01)。而基础状态下β3-/-小鼠BH4/(BH2+生物嘌呤)比值较WT小鼠下降了25%(1.49±0.2 vs. 1.91±0.3,P<0.05),TAC后没有进一步下降。(11)给予FVBβ3-/-/ TAC小鼠BH4补充性治疗后,治疗组小鼠心肌收缩力较安慰剂组明显提高(-0.4±0.2 vs. -16.1±4.9%, P<0.05 vs.β3-/-/TAC),左室重量较安慰剂组显著降低(+15.0±6.8 vs. +81.8±13.7 %, P<0.01 vs.β3-/-/TAC)。(12)β3-/-/TAC BH4治疗组小鼠心肌NOS来源的O2-活性较安慰剂治疗组显著下降(P<0.05 vs.β3-/-/TAC+vehicle; P=NS vs.β3-/-/sham and WT/sham)。(13)C57BL/6 WT小鼠经27G TAC手术3周后心腔扩大,心肌收缩力下降。与sham组小鼠比较LVEDD增加82%(2.00±0.20 vs.1.10±0.03 mm; P<0.001),小轴缩短率降低36%(39.1±4.5 vs. 61.4±0.3 %;P<0.001)。左室重量(172±13 vs. 76±5 mg; P<0.001)和室壁厚度(1.21±0.04 vs. 0.84±0.02 mm; P<0.001)也较sham组小鼠增加。而通过皮下植入微量泵给予0.1 mg/kg/day BRL治疗完全防止了压力负荷所致的心腔扩大(LVESD 1.32±0.06 mm; P=NS vs. sham, P<0.01 vs. TAC)和心功能下降(FS% 57.8±1.4%; P=NS vs. sham, P<0.001 vs. TAC)。BRL治疗组小鼠左室重量和室壁厚度也较安慰剂组明显下降(P<0.001 vs. TAC)。(14)BRL治疗组小鼠与安慰剂组比较心肌肥厚的程度明显减轻(HW/TL 100±4 vs. 122±8 mg/cm; P<0.05),心肌细胞直径较安慰剂组明显降低(13.31±0.21 vs. 15.81±0.35μm, P<0.001)。然而BRL治疗对心肌纤维化无明显改善(1.50±0.35 vs. 1.67±0.33, P =NS)。(15)硝酸还原酶法测定的心肌NO终末产物硝酸盐和亚硝酸盐浓度在TAC 3周后较shan组小鼠降低50%(5.03±0.52 vs. 10.10±1.99μM, P<0.05)。BRL治疗组小鼠心肌NO活性恢复正常水平(13.73±1.84μM, P<0.01 vs. TAC; P=NS vs. sham)。(16)WT小鼠27G TAC 3周后心肌总O2-活性较对照组增加约2.5倍(21459±782.8 vs. 6099±1703 CPM/mg; P<0.001),BRL治疗组小鼠心肌总O2-活性较安慰剂治疗组明显下降(14017±838.2 CPM/mg; P<0.01)。更为重要的是,BRL对心肌超氧阴离子的抑制作用在nNOS特异性地拮抗剂L-VNIO的作用下完全消失(21992±75.68 vs. 21063±2930 CPM/mg; P=NS vs. TAC)。(17)TAC后,eNOS单体/二聚体比值显著增加(m/d 1.10±0.24 vs. 0.45±0.05; P<0.05),eNOS二聚体解离,然而BRL治疗并没有降低eNOS单体/二聚体比值(1.01±0.02; P=NS vs. TAC。(18)BRL对eNOS总蛋白表达量没有明显改变。但BRL治疗组小鼠心肌p-eNOSSer1177/eNOS比值较安慰剂治疗组明显降低(0.92±0.01 vs. 1.40±0.02; P<0.01)。而p-eNOSSer114/eNOS比值则较安慰剂治疗组增加了1倍(4.64±0.60 vs. 2.33±0.22; P<0.05)。p-eNOSThr495/eNOS比值在各组间也无明显变化。(19)压力负荷3周后小鼠心肌nNOS表达无明显变化,而BRL治疗组小鼠心肌nNOS蛋白表达量是安慰剂治疗组的3倍(1.11±0.22 vs. 0.39±0.17; P<0.05 vs. TAC)。iNOS蛋白表达在TAC后略有增加,但BRL对iNOS蛋白表达无影响(0.34±0.09; P=NS vs. TAC)。研究结论:(1)老年和轻度压力负荷后β3-/-较野生型小鼠发生了更为严重的心肌肥厚,心肌纤维化,心室腔扩大和心功能下降。(2)压力负荷时β3-AR基因敲除小鼠心肌发生NOS解耦联,NOS生成NO的水平下降,而生成活性氧水平增加。(3)压力负荷时β3-AR基因敲除小鼠心肌组织GTPCH- 1的蛋白表达量和BH4/(BH2+生物嘌呤)的比值下降可能是NOS解耦联的原因。外源性补充BH4治疗明显改善了压力负荷所致的心脏功能下降和左室肥厚。(4)给予野生型小鼠选择性β3-AR激动剂BRL治疗3周完全预防了压力负荷所致的心腔扩大,心脏功能下降,并部分地抑制了心肌肥厚的发展。(5)β3-AR激动剂治疗后心肌NO活性恢复正常,ROS活性降低,且BRL对ROS活性的抑制作用是通过nNOS实现的。(6)BRL治疗对eNOS二聚化水平,eNOS蛋白表达没有改变,但显著上调了nNOS的蛋白表达水平。综上所述,本研究从正反两面证实了β3-AR信号转导通路对压力负荷小鼠具有重要的保护作用。β3-AR通过调控NOS偶联发挥其心血管保护作用。这一研究为心肌肥厚和心力衰竭的防治提供了新的思路和理论依据,具有重要的临床应用价值。