痢疾和霍乱都是重要的肠道传染病,其病原体分别为志贺氏菌(Shigella Spp.)和霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)。对痢疾和霍乱的治疗多依赖抗生素,但抗生素的长期使用会导致细菌的耐药性增加,也容易出现多重耐药菌株。接种疫苗是最经济和有效的预防手段,但目前还未研发成功预防细菌性痢疾的安全有效疫苗,预防霍乱也多用针对O1群的重组B亚单位/霍乱菌体疫苗,O139群尚无预防性疫苗。开展多糖结合疫苗的研究具有重要意义。利用多糖的免疫原性制备的多糖疫苗属于T细胞非依赖性抗原,其免疫过程中没有T细胞的参与,也不形成免疫记忆,产生的抗体亲和力较低。将细菌的多糖与适当的蛋白载体结合而形成的糖蛋白疫苗属于T细胞依赖性抗原,能引起T、B细胞的联合识别,明显提高免疫效果,还可形成免疫记忆。蛋白糖基化过程与细菌脂多糖的合成具有很大的相似性,细菌具有糖基化修饰功能,pgl基因簇表达糖基转移酶的发现,这些都使得O多糖与蛋白载体在细菌体内结合为糖蛋白成为了可能。生物法合成糖蛋白疫苗成本低,操作简单,只需要一步纯化工作即可得到所需糖蛋白;由于糖基化位点明确,其制备的糖蛋白均一性好,方便质量控制。本研究利用实验室前期构建的福氏2a志贺氏菌301 waa I缺失突变株,转入含有脑膜炎奈瑟球菌蛋白糖基化途径中寡糖基转移酶(Pgl L)的表达载体,以及含有霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTB)的表达载体,使该重组菌在诱导条件下,形成了以痢疾OPS(O-specific polysaccharides)为目标抗原、以CTB为载体蛋白的痢疾OPS-CTB糖蛋白复合物。接下来利用底物蛋白自身的性质以及所带有的His标签,经过亲和层析与离子交换层析,最终得到痢疾多糖结合蛋白的纯化样品,并验证了糖蛋白的存在形式为聚体状态。之后对糖蛋白纯化产物进行免疫原性评价,选取小鼠作为实验动物,用2.5μg量的纯化后糖蛋白对其进行免疫,并用OPS组、佐剂组分别做对照,用间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度来探究其免疫原性。ELISA测定血清抗体滴度显示,CTB作为载体蛋白能有效增加糖链的免疫原性;糖蛋白刺激小鼠生成了Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3抗体,其中主要为Ig G1抗体;糖蛋白可导致机体同时产生细胞免疫应答和体液免疫应答,且以体液免疫应答为主。最后对免疫后的各组小鼠进行攻毒实验,以最小致死量作为攻毒剂量,观察一周后结果显示,OPS组、佐剂组、空白组小鼠全部死亡,糖蛋白组各有小鼠存活,由此说明免疫小鼠后血清中的抗痢疾OPS的Ig G为保护性抗体,CTB-OPS糖蛋白作为疫苗对于机体抵御志贺氏菌的侵袭有一定的保护能力。本研究利用生物合成法成功制备了痢疾O多糖蛋白结合疫苗候选株。此外,本实验还发现,将糖基化系统导入未敲除waa I基因的野生株内,经诱导后其也能表达糖蛋白,虽然此糖蛋白与waa I缺失株表达的糖蛋白的糖型略有差异,但在免疫小鼠后引起的血清效价中,两组之间并无明显的差异。这为之后的研究提供了一个新的思路,在不容易敲除基因的菌株中,可以先不敲除基因,而是尝试导入糖基化系统,看其是否可在野生株表达。本实验采用自杀载体p WM91与细菌基因组重组的方法,成功构建了霍乱O139群93-3菌株waa L基因缺失株;之后,对所构建的菌株进行生理生化特征研究,结果表明waa L的缺失对细菌的生长几乎没有影响。缺失株的构建,为下一步将糖基转移酶和底物蛋白克隆到此菌株中并获得针对霍乱弧菌O139群的糖蛋白疫苗奠定了基础。