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肝细胞癌(HCC)是肝癌中的一种常见的类型,其发病率及死亡率在全球常见恶性肿瘤中均位于前列。通常肝细胞癌患者被确诊时已经处于癌症晚期,错过了通过手术治疗的最佳时机,目前探究肝细胞癌的早期诊断方法仍是一个急需解决的问题。因此研究肝癌发生发展过程中的分子水平变化及调控机制,为肝癌的诊断提供靶点,具有极其重要的意义。CRK最初发现于禽类肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,作为一种癌基因其由SH2和SH3结构域组成。CRK家族包括三个成员:CRKI、CRKII和CRKL这三个分子在人体的各个组织中都具有表达的情况。最近几年的研究情况表明:CRKL与多种肿瘤的发生发展密切相关,CRKL主要通过参与调控细胞内的信号传导,参与组织癌变过程等。但CRKL在人肝细胞癌中的功能及与其他分子之间的调控机制尚无研究。MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的包含18-24个碱基的单链非编码RNA。mi RNAs能够特异性结合靶基因mRNA的3’-UTR区导致靶基因mRNA降解或抑制靶基因的翻译。前期我们在生物信息学软件上发现miR-429与CRKL存在靶向关系,但二者在肝细胞癌中的相关性研究未见报道。ETV6又称TEL,是转录因子ETS家族中的一员,一直被认为是造血干细胞的一个重要的转录调控因子。生物信息学发现其能潜在与miR-429的DNA启动子区结合,可能进一步调控miR-429的转录。ETV6与miR-429的关系及其进一步对CRKL的调控作用无人研究。目的:1.CRKL表达水平与肝癌临床相关性的探究;2.CRKL水平变化对肝癌恶性表型的调控探究;3.建立CRKL与miR-429和ETV6的相互调控关系。方法:1.WB和IHC的方法检测肝癌临床样本和肝癌细胞中CRKL蛋白表达水平检测;2.慢病毒感染法构建CRKL过表达的肝癌细胞株;3.MTT法检测CRKL过表达对肝癌细胞体外增殖影响;4.Transwell法检测CRKL过表达对肝癌细胞体外迁移和侵袭影响;5.通过倒置荧光显微镜观察CRKL过表达对肝癌细胞显微形态的影响;6.鬼笔环肽染色法检测CRKL过表达对肝癌细胞骨架影响;7.WB和qRT-PCR法检测CRKL水平变化肝癌细胞株中ETV6和miR-429水平影响8.WB和qRT-PCR法检测miR-429和CRKL在ETV6敲低肝癌细胞中表达水平的变化9.双荧光素报告实验探究miR-429与CRKL靶向关系;10.免疫共沉淀实验研究CRKL与ETV6结合;11.染色质免疫共沉淀实验研究ETV6与miR-429启动子区的结合。结果:1.30例肝癌临床样本和48例肝癌组织芯片分析结果表明:CRKL在肝癌患者组织中高表达;2.CRKL在肝癌细胞中比在正常肝细胞中表达量高;3.获得HepG2、HCCLM3和HuH7的CRKL稳定过表达细胞株,过表达效率分别为310%、180%和80%;4.CRKL过表达提高肝癌细胞体外增殖能力;5.CRKL过表达增强肝癌细胞体外迁移侵袭能力;6.CRKL过表达能够影响肝癌细胞的显微形态并且促进细胞骨架的形成;7.在肝癌细胞中ETV6与CRKL表达水平正相关,miR-429与CRKL表达水平负相关;8.ETV6下调后miR-429靶向CRKL的水平降低,从而降低CRKL在肝癌细胞中的表达;9.CRKL通过与ETV6结合增强ETV6表达水平;11.ETV6与miR-429启动子区结合来发挥作用。结论:1.CRKL在肝癌样本中高表达;2.CRKL在人肝癌细胞中高表达;3.CRKL过表达能够提高肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;4.miR-429靶向结合CRKL 3’-UTR,靶向负调控CRKL表达;5.CRKL通过与ETV6直接结合而调控ETV6表达;6.ETV6与miR-429的启动子区结合抑制其转录。总体来说,在肝癌中CRKL过表达并促进肝癌的发生与发展。