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对急性心肌梗塞的再灌注治疗已经成为一种重要且不可或缺的方法,然而对随之而来的再灌注损伤目前无切实、有效的方法,是当今心血管医学界迫切需要解决的棘手问题之一。近年来随着干细胞学研究及分子生物学技术的突破性进展,为缺血再灌注损伤的治疗带来了新的希望。然而选取取材容易的、存活时间长、无致瘤性、分化能力强的干细胞,以及提高干细胞在缺血缺氧环境中生存率是目前干细胞治疗的焦点。羊水间充质干细胞具有易取得、无伦理学问题、存活时间长、分化能力强等特点,是优良的干细胞选择。另外近年来发现基因修饰对改善干细胞的存活率有一定的效果。课题组前期已经成功分离和培养兔羊水间充质干细胞,在体外经诱导可分化为心肌样细胞;构建兔Akt过表达慢病毒载体并成功转染羊水间充质干细胞。现为明确Akt基因修饰羊水间充质干细胞移植对缺血再灌注损伤心肌的作用和可能机制,我们通过体内和体外实验进一步深入研究。第一部分缺氧对Akt基因修饰羊水间充质干细胞的作用研究目的:探讨在体外缺氧对Akt基因修饰羊水间充质干细胞的影响。方法:培养空病毒转染的羊水间充质干细胞(null-AFMSCs)和Akt基因慢病毒转染的羊水间充质干细胞(Akt-AFMSCs),两组细胞分为正常组和缺氧组。WST-1法检测null-AFMSCs和Akt-AFMSCs分别在正常和缺氧环境下12小时的存活率;Western Blot检测显示各组表达P-Akt水平;运用caspase-3活性检测试剂盒检测null-AFMSCs和Akt-AFMSCs在正常和缺氧下促凋亡因子caspase-3活性表达;real-time PCR方法检查细胞培养液中的细胞因子VEGF、HGF、b FGF和IGF-1等的表达。结果:WST-1法检查显示在缺氧组中Akt-AFMSCs的存活率明显高于null-AFMSCs(P<0.05);Western Blot检测显示缺氧组中P-Akt表达均升高,且Akt-AFMSCs表达P-Akt水平明显高于null-AFMSCs(P<0.05);Akt-AFMSCs在体外缺氧环境中caspase-3活性水平低于null-AFMSCs(P<0.05);real-time PCR检查显示缺氧组中Akt-AFMSCs较null-AFMSCs分泌更多的细胞因子VEGF、HGF、b FGF和IGF-1等(P<0.05)。结论:缺氧可使AFMSCs表达P-Akt升高;Akt基因修饰能使P-Akt表达进一步升高,增强AFMSCs在体外对缺氧的耐受力,促使其分泌更多的细胞因子,从而可能使其发挥促增殖分化、促微血管生成、抗凋亡等作用增强。第二部分Akt基因修饰羊水间充质干细胞移植对兔缺血再灌注损伤心肌的作用研究目的:探讨Akt基因修饰羊水间充质干细胞移植对兔缺血再灌注损伤心肌的作用和机制。方法:培养空病毒转染的羊水间充质干细胞(null-AFMSCs)和Akt基因慢病毒转染的羊水间充质干细胞(Akt-AFMSCs)。将新西兰兔分成4组,分别为假手术组、对照组(心肌注射DMEM)、null-AFMSCs组(心肌注射null-AFMSCs)和Akt-AFMSCs组(心肌注射Akt-AFMSCs)。制备兔心肌缺血再灌注模型,在再灌注开通前将5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记的null-AFMSCs和Akt-AFMSCs分别移植到null-AFMSCs组和Akt-AFMSCs组的梗死心肌和周边区。移植后21天超声心动图测定心功能;然后处死取心肌组织。HE染色观察病理变化,masson染色观察心肌纤维化,透射电镜观察移植后心肌的超微结构,TTC染色比较心肌梗死范围,免疫荧光检测心肌组织中移植羊水间充质干细胞的分布,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,RT-PCR方法检测心肌组织GATA-4表达,免疫组化法检测c TNT、毛细血管表达,western-blot法检测connexin-43、VEGF、Akt、P-Akt、caspase-3和bcl-2表达等。结果:羊水间充质干细胞细胞移植后21天,心脏超声心动图显示与对照组比较,null-AFMSCs组和Akt-AFMSCs组FS、EF明显升高(P<0.05);且Akt-AFMSCs组较null-AFMSCs组FS和EF升高更明显(P<0.05)。TTC染色显示Akt-AFMSCs组的心肌梗死面积明显低于对照组和null-AFMSCs组[(10.4±2.6)%比(26.3±2.5)%和(17.5±3.3)%,(P<0.05)]。HE染色显示Akt-AFMSCs组病理损伤变化明显减轻。透射电镜观察Akt-AFMSCs移植后心肌肌丝溶解和断裂、基质空化等变化较null-AFMSCs组减轻。免疫荧光显示缺血再灌血注心肌中残存少量移植的羊水间充质干细胞,但Akt-AFMSCs组残存的羊水间充质干细胞多于null-AFMSCs组(P<0.05)。与对照组和null-AFMSCs组比较,Akt-AFMSCs组心肌细胞凋亡数量明显减少(P<0.05)。免疫组化显示Akt-AFMSCs组缺血再灌注损伤心肌中微血管数量和心肌细胞特异性c TNT表达明显多于对照组和null-AFMSCs组(P<0.05)。western-blot检测显示Akt-AFMSCs组缺血再灌注心肌组织中p-Akt、bcl-2、VEGF、connexin-43表达较对照组和null-AFMSCs组升高,caspase-3蛋白表达减低(P<0.05)。结论:羊水间充质干细胞移植入兔缺血再灌注损伤心肌中,具有修复损伤心肌、减少梗死面积、改善心脏功能的作用;而Akt基因修饰羊水间充质干细胞移植获益则更显著。其修复作用机制可能与减少心肌细胞凋亡、促进血管新生、Akt基因转染增强细胞耐缺氧以及旁分泌作用等有关。