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【目的】Livin作为一种凋亡抑制蛋白,在多种恶性肿瘤(包括肺癌)中高表达,其高表达可促进肺癌发生并能够降低肺癌对放、化疗的敏感性。本研究拟通过体外、体内实验阐明其在肺癌侵袭转移中的机制,以期为以Livin为靶点的肺癌基因治疗提供理论依据。【方法】利用前期研究所筛选敲减livin的有效靶点构建携带有livin-sh RNA慢病毒载体,进行细胞感染。根据对A549细胞的不同处理,实验过程分为三组。实验组(KD):携带有Livin-sh RNA以及e GFP慢病毒系统转染的细胞;阴性对照组(NC):携带e GFP及无关序列慢病毒系统转染的细胞;空白组(CO):未做任何处理的野生型A549细胞。通过Realtime-PCR、Western-blot验证敲减效应后;在体外水平,利用细胞克隆形成实验及MTT检测细胞生长、增殖情况;ELISA测定三组细胞VEGF的分泌水平;Transwell小室侵袭实验和明胶酶谱法检测细胞的侵袭力;将75只BALB/C裸小鼠随机分为三组,将三组细胞以2.5×106/只数量分别经尾静脉注射入裸鼠在肺内成瘤,在注射后的5、6、7、9周对裸鼠进行动态荧光示踪,并同一时间点处死后动态监测肺部转移情况,Realtime-PCR、Western-blot、免疫组化检测裸鼠肺组织Livin基因及其下游信号通路相关基因VEGF、MMP2、MMP9、VEGFR2的表达情况。每组余下各9只裸鼠进行生存期观测。【结果】1在荧光显微镜下,观测到在KD和NC组中超过95%的细胞携带有绿色荧光,在CO组中未见荧光。利用Realtime-PCR和Western-blot结果显示KD组的m RNA表达水平最低(P<0.05);KD组蛋白表达水平与NC组相比减少超过了86%(P<0.05),均表明实现了对Livin基因的沉默。2细胞克隆形成实验及MTT实验所绘制生长曲线表明,实验组细胞的生长和增殖较阴性对照组或空白组慢(P<0.05)。ELISA结果显示实验组细胞培养液中VEGF的浓度(25.7±2.5 pg/ml)较阴性对照组(71.9±4.3 pg/ml)及空白组(83.1±4.1 pg/ml)显著减少(P<0.001)。3 Transwell小室侵袭实验和明胶酶谱法结果表明,KD组的穿膜细胞数比NC组和CO组的少(P<0.001),KD组比NC组MMPs的活性降低超过50%。在细胞水平证实沉默Livin基因通过调控MMPs活性以降低肺腺癌细胞侵袭力。4裸鼠肺转移模型造模成功率为100%,对裸鼠肺部大体观、病理HE染色分析,实验组肺部瘤结面积相对率(11.07%±2.94%),明显少于阴性对照组(46.71%±7.27%)(P<0.001),沉默Livin基因可抑制裸鼠肺部瘤结的形成。5观察三组裸鼠的生存期,绘制K-M生存曲线,显示实验组及阴性对照组生存期较空白组缩短(P<0.001);实验组和阴性对照组的生存期无统计学差异(P>0.05)。裸鼠体内动态荧光示踪,未见肺部及其他脏器等部位的特异性荧光,仅见散在的假阳性荧光。【结论】1沉默Livin基因可通过调控VEGF信号途径抑制肺癌细胞生长和增殖,可通过调控MMPs信号途径减弱细胞的侵袭能力。2沉默Livin基因可减少体内肺部转移瘤的形成;然而转移瘤动物模型的生存期反而缩短,需考虑增强绿色荧光蛋白、慢病毒载体系统在动物体内的毒性。3 Livin在肺癌转移中起重要作用,有望成为具有前景性的抗肺癌靶点。4经尾静脉建立的肺癌转移模型可靠而稳定,可通过时间依赖的方式来分析肺癌的转移能力。