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背景:胰腺癌(pancreatic cancer,Pa C)发病隐匿,发现时多数患者都已近晚期,同时由于恶性程度较高,导致Pa C预后极差,5年生存期<5%。因此,寻找新的Pa C生物标志物已经成为极其紧迫和重要的任务。早在20世纪初期,人们就发现Pa C与糖尿病(diabetes mellitus,DM)之间的关系,近年来多项大型临床流行病调查及基础实验研究表明,部分病程小于3年,无明显代谢因素参与的新发DM可能是胰腺癌相关性糖尿病(pancreatic cancer-associated DM,Pa C-DM),故对于Pa C-DM的研究具有极其重要的临床意义。Pa C-DM的发病机制目前还不清楚,在小Pa C和Pa C早期患者中DM与葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)障碍高发,同时往往会偏向一个体液过程而不是一个局部肿瘤效应,而胰岛β细胞易受到体液循环因素造成的损伤。目前,多项体外与人体研究表明Pa C中胰岛素抵抗与胰岛β细胞损伤可能是由肿瘤分泌低分子量的蛋白质或者多肽引起的。因此我们推测胰岛β细胞是Pa C-DM发生发展中的主要目标。近年来,循环mi RNA的发现为Pa C的早期诊断提供了极大的契机,这种稳定存在于血清中的循环mi RNA已被广泛研究证明可用于肿瘤等疾病的早期诊断、个体化治疗、预后判断等诸多方面。而血浆中的mi RNA多数不是以游离形式存在的,绝大部分被包裹在微囊泡(microvesicle,MV)中,这些MV可以携带着mi RNA进入靶细胞,改变靶细胞的生物学功能,这一现象为人们对研究Pa C-DM发生发展的可能分子机制研究提供了全新的思路。目的:(1)筛选出Pa C-DM患者特异血清mi RNA表达谱,评价其对Pa C-DM诊断价值。(2)研究胰腺癌细胞通过MV分泌的mi RNAs对胰岛?细胞功能及凋亡的影响。(3)预测并验证在Pa C-DM患者血清及MV中明显差异表达mi RNA的靶基因。(4)动物实验研究,胰腺癌皮下移植瘤对植瘤小鼠糖代谢的影响,以及稳定上调明显差异表达的mi RNA对植瘤小鼠胰岛?细胞功能的影响。方法:(1)收集未经任何治疗的初入院Pa C-DM患者血清,同时收集与患者年龄、性别匹配的单纯2型DM患者血清及正常对照,使用低密度芯片技术(Taq Man Low density array)、实时荧光定量PCR等实验技术筛选稳定变化的Pa C-DM特异性血清mi RNA表达谱。(2)利用差速离心和密度梯度离心法,从患者血浆及体外培养细胞的培液上清中分离出微囊泡(microvesicle,MV),检测MVs中富含mi RNA,选定差异表达最明显的mi RNA,采用过表达或干扰技术明显上调或下调该mi RNA,检测其对胰岛?细胞生物学功能的影响。(3)根据多个权威生物信息学预测网站预测目标mi RNA的靶基因,采用定量PCR及Westernblot实验进行验证。(4)构建SW1990细胞皮下移植瘤小鼠模型,通过糖耐量试验(IPGTT)及胰岛素耐量实验(ITT)检测胰腺癌皮下移植瘤对植瘤小鼠的糖代谢的影响,通过定量PCR检测小鼠血清中mi RNAs的表达及Westernblot检测胰岛细胞中靶基因的表达。结果:(1)通过低密度芯片技术及q RT-PCR技术在训练集及验证集中对Pa C-DM(70例)、DM(75例)及正常对照(70例)进行了逐个血清样本的检测,我们发现在mi R-483-5p、mi R-19a、mi R-29a、mi R-20a、mi R-24、mi R-25在Pa C-DM患者血清中的表达量发生了明显上升,且与病程小于3年的新发2型糖尿病及正常人血清中的表达量具有明显差异,并具有极显著统计学意义(变化倍数为2.45~3.88倍,p<0.0001)。使用6种mi RNA联合诊断Pa C-DM的ROC曲线下面积AUC=0.841,高于传统肿瘤标志物CA199(AUC=0.741)。(2)mi R-19a在Pa C-DM病人的血清中显著升高,同时Pa C-DM患者血清及胰腺癌细胞培液上清中的MV可特异性包裹mi R-19a。通过体外实验证明了Bxpc-3、PANC-1及SW1990三种胰腺癌细胞分泌的mi R-19a能够进入胰岛?细胞及原代胰岛,并能够靶向调节胰岛素转录过程中Neuro D1的蛋白水平。(3)同时,上述三种胰腺癌细胞分泌的MV都能引起胰岛?细胞及原代胰岛的凋亡增加。(4)体内实验也证明了SW1990胰腺癌皮下植瘤可诱导部分植瘤小鼠产生GSIS障碍,以及血清mi R-19水平上调及胰岛Neuro D1水平下调。结论:(1)本研究证明了mi R-483-5p、mi R-19a、mi R-29a、mi R-20a、mi R-24、mi R-25这6个micro RNAs对以Pa C-DM患者具有早期诊断的潜在价值,可以成为对病程小于3年的新发2型DM患者进行Pa C早期筛查的重要血清学指标,为提高Pa C早期诊断率提供新思路和新方法。(2)Pa C-DM患者血清及胰腺癌细胞培液上清中的MV可特异性包裹mi R-19a。通过体外及体内实验证明了,Bxpc-3、PANC-1及SW1990三种胰腺癌细胞分泌的mi R-19a能够进入胰岛?细胞及原代胰岛,并能够靶向下调胰岛素转录过程中Neuro D1的蛋白水平影响胰岛素的分泌;同时胰岛细胞分泌的MV也可引起胰岛?细胞及原代胰岛的凋亡增加,参与Pa C-DM的发生。