[背景]骨肉瘤是一种在青少年中多发并且能够严重危害到人类生命健康的恶性骨肿瘤。通常单纯手术治愈率大约在15%～20%左右,并且会导致患者肺转移、截肢甚至死亡。经过药物治疗骨肉瘤病人的5年生存率能够提高到70%左右,研究人员在临床治疗中得出骨肉瘤能够对一些抗肿瘤药物产生耐药性包括铂类、多柔比星、MTX以及阿霉素等等[1]。骨肉瘤产生的耐药性对选择治疗方案以及病人的预后都会产生不利的因素,并能够严重影响骨肉瘤病人的生存率。只有研究骨肉瘤耐药的分子机制,才能逆转化疗耐药问题,减少骨肉瘤复发,提高患者生存率。化疗耐药过程由多因素、多水平、多基因参与调控的。产生耐药性的具体机制暂时没有明确的结论,为了研究骨肉瘤的耐药机制,学者们采用抗癌药物诱导的方法建立多药耐药细胞模型。曾恒[1]等采用阿霉素间断大剂量冲击诱导法快速建立了多药耐药MG-63细胞株,说明化疗药阿霉素本身就是耐药的诱因,也就是说阿霉素引发的变化反过来会影响其发挥细胞杀伤作用,这种耐药机制是本研究的重点。很多机制都可能与骨肉瘤产生耐药性有关,其中包括细胞的膜转运蛋白异常和细胞凋亡调控异常以及肿瘤干细胞的形成甚至是细胞内解毒系统作用等等,是多基因、多水平参与、多因素调控的过程。细胞凋亡异常是肿瘤恶性生物学行为的主要原因之一。调控肿瘤细胞凋亡异常的过程可以由众多凋亡蛋白以及相关基因参与,和骨肉瘤凋亡有关的基因包括BCL2家族、FAS/FASL家族、CASPASES(半胱天冬酶)以及P53家族等。骨肉瘤的常用抗肿瘤药物发生耐药机制目前还没有明确的定论,目前认为主要会涉及药物的作用靶点突变、DNA修复、药物的作用靶点突变以及药物的摄取相关蛋白的改变等[2]。经过研究可以得出与细胞的凋亡过程和原癌基因关系密切。尽管BC1-2是原癌基因,但是BC1-2并没有增殖的作用也不能够使细胞向恶性转化,但是BC1-2可以在无生长因子或神经营养因子存在的条件下使细胞病毒感染的机会延长并且能够让细胞染色体畸变的概率增加,从而使细胞恶变形成肿瘤。现阶段BC 1-2基因被一些研究人员认为有着抑制细胞凋亡的作用,BC1-2能够使许多引起细胞凋亡的因素得到抑制从而抑制细胞凋亡。miRNA是非编码RNA家族中的一员,也是转录后调控基因表达的主要小分子。经过研究可以得出miRNA能够在大多数肿瘤中起到抑癌基因的效果,特定的miRNA能够参与肿瘤发生、发展的众多阶段[3]。一些成熟的miRNA可以和RNA诱导的沉默复合物结合后形成复合体。miRNA能够直接对50%的蛋白编码基因产生作用,同时也能够参与大多数的生理过程,可以包含细胞生长和细胞分化以及细胞凋亡和脂类代谢等等。miRNA也能够对许多癌症发挥出重要的作用,其中包括肺癌、白血病、结肠癌和骨肉瘤等。因为miRNA能够调控多个蛋白质的编码基因,所以miRNA可以使有关的主要信号通路或者功能分子受到影响。由此可知miRNA相关信号通路和靶基因一起组成了一个非常复杂的调控网络,其中niRNA能够发挥出十分重要的生理功能[4]。只要表达失控,就能够导致某些病理过程的进展。经过研究可以得出miRNA在骨肿瘤中能够处于异常状态,有些miRNA被上调也有些miRNA则被下调,这些miRNA能够在肿瘤的发生与肿瘤的发展中起到抑癌基因或者癌基因的作用。有一些miRNA在骨肉瘤的发生与骨肉瘤发展中,能够产生促进作用。另外也有一些miRNA在骨肉瘤的发生与骨肉瘤发展中能够产生抑制作用,经过对骨肉瘤和miRNA关系的研究,能够使miRNA在骨肉瘤中的作用机制得到证实,并且可以为骨肉瘤的临床治疗中提出新的作用靶点。miR-184作为microRNA成员,现阶段已经得出它与肿瘤的发生以及肿瘤的发展有着密切的联系。现阶段在肺癌、肝癌、鼻咽癌等多数的肿瘤中miR-184的表达异常,能够作为癌基因调控分子或者通过调节BCL2与C-MYC信号通路,以及上调SND 1信号来促使肿瘤发生。因为在骨肉瘤中对miR-184的研究目前并没有公开作出证明,所以我们对它的分子机制研究目前尚不清楚。我们前期研究己经证明了miR-184在骨肉瘤细胞中的表达,所以我们可以对miR-184能够参与骨肉瘤耐药的调节进行预测。目前尚没有关于miR-184参与骨肉瘤耐药的报告,所以本研究拟探讨miR-184对骨肉细胞耐药发生发展的影响和机制,从而为临床中的逆转骨肉瘤耐药的治疗提供了新的作用靶点。本研究主要包括四个部分：第一章阿霉素影响microRNA-184在骨肉瘤细胞中表达的验证；第二章microRNA-184影响阿霉素促凋亡作用的研究；第三章microRNA-184靶基因BCL2L1的验证；第四章MicroRNA-184影响阿霉素对BCL2L1抑制作用的研究。[目的]1、研究阿霉素对microRNA-184表达的影响和对骨肉瘤细胞的杀伤作用。2、研究microRNA-184对阿霉素促凋亡作用的影响和分子机制。[方法]1、细胞培养人骨肉瘤U-2 OS/MG-63细胞系,购买自中国科学院生化与细胞生物研究所细胞库；含10%的热灭活胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml的高糖DMEM培养基被用于培养骨肉瘤细胞。2、实时荧光定量PCR测定microRNA-184合成microRNA-184 (miR-184)和内参U6的real-time PCR引物。为了测定miR-184的表达,骨肉瘤U-2 OS/MG-63细胞系分别暴露于0.5 nM或1.0 nM阿霉素达Oh、6h、12h、24h、48h后收集细胞。骨肉瘤细胞总RNA被提取、逆转录后进行实时荧光定量聚合酶链反应并以U6 snRNA作为内参。miRNA基因干扰实验分为control组、NC组、Agomir组、Antagomir组共四组。转染前确认细胞状态良好。参考lipo2000转染剂使用说明和锐博miRNA基因干扰试剂的使用说明进行细胞转染,48h后四组细胞更换新鲜培养基,其中NC组、Agomir组、Antagomir组培养基为含浓度0.5nM阿霉素的上述培养基。4、流式细胞仪分析细胞凋亡率细胞转染成功24h后在流式管中轻柔加入缓冲液使得细胞充分悬浮；流式管先后加入Annexin V-FIFC、7AAD混匀反应后开始流式细胞仪的分析并计算凋亡率。5、验证miR-184靶点实验含miR-184结合位点的野生型BCL2L1 3’UTR和突变型BCL2L1 3’UTR的双荧光素酶报告质粒由Promega公司合成并鉴定,它们被分别与miR-184激动剂共转染人293T细胞。转染后检测荧光素酶活性并计算萤火虫荧光/海肾的荧光的比值,证实miR-184对BCL2L1表达的影响。6.阿霉素影响BCL2L1蛋白表达分析。通过Western-blot技术检测骨肉瘤细胞BCL2L1蛋白表达情况。取人骨肉瘤细胞U-2 OS经过复苏培养,第一次传代后,更换培养液为含浓度0.5nM或1.0nM阿霉素上述培养基。分别于0h,6h,12h,24h,48h提取细胞的总蛋白后进行进行SDS-PAGE电泳,通过Western blot检测验证BCL2L1蛋白差异性表达,并以GAPDH为内参。7、microRNA-184和阿霉素共同影响BCL2L1表达的分析骨肉瘤细胞以1x105/孔密度接种于装有载玻片的12孔平板上,当骨肉瘤细胞生长至2x105/孔时分别应用microRNA-184激动剂和拮抗剂进行基因干扰,48小时后细胞暴露于含0.5nm阿霉素的培养基中,24小时后提取细胞的总蛋白后进行SDS-PAGE电泳,通过Western blot检测验证BCL2L1蛋白差异性表达,并以GAPDH为内参。8.统计分析：运用统计软件SPSS20.0进行分析,取4次其独立实验的平均值,所有数据均以均数土标准差表示。对于不同时间点的测定,使用两个重复测量因素的方差分析。其余结果分析采用单因素方法分析,满足方差齐性时应用LSD法进行多重比较,当方差不齐时应用Dunnett’s C法进行多重比较,取4次其独立实验的平均值,检验水准为：α<0.05,选用95%作为可信区间,p<0.05可以认为差异具有统计学意义。[结果]1.阿霉素对体外培养的人骨肉瘤细胞表达水平的影响研究结果显示,在0.5nm浓度的阿霉素作用下,体外培养的两种骨肉瘤细胞系,U-2 OS和MG-63均自6小时上调miR-184表达(P<0.05),到表达高峰后均显著下调(P<0.05)。与低浓度相比,1.0nm浓度的阿霉素作用下的miR-184上调幅度更高(P<0.05),且下降幅度低于低浓度的影响(P<0.05)。2.miR-184异常表达影响细胞的凋亡结果显示,阿霉素引发骨肉瘤细胞凋亡率增加。与阴性对照组相比,上调miR-184可降低凋亡率(P<0.05),即削弱由阿霉素所引发的U-2 OS细胞凋亡。而下调miR-184可提高凋亡率(P<0.05),即有利于阿霉素发挥促细胞凋亡作用。此表现同样见于MG-63细胞。3. BCL2L1是miR-184的靶基因通过PCR的扩增产生的突变型以及野生型载体经过测序证实和之前预测的序列相同。双酶切后连接在双荧光素酶载体上,并且成功的构造出突变型的双荧光素酶表达载体以及野生型的双荧光素酶表达载体。对照组以及实验组的载体在和miR-184激动剂共转染细胞后,经过检验得出跟突变型载体相比,野生型载体荧光素酶的活性显著增加。4.阿霉素抑制BCL2L1表达以浓度0.5nm的阿霉素处理人骨肉瘤U-2 OS细胞系,分别在Oh,6h、12h、24h、48h四个时间点,采用Western-blot检测BCL2L1的表达情况,结果发现随时间推移,BCL2L1的表达逐渐减低(P<0.05)。阿霉素抑制BCL2L1的表达,并随时间推移而作用增强。5. microRNA-184削弱阿霉素对BCL2L1的抑制作用为探明miR-184的干扰作用,采用Western-blot测定BCL2L1的表达,结果显示,与未处理组(control组)相比,阴性对照组(NC组)BCL2L1的表达受到阿霉素明显抑制。miR-184激动剂转染组(Ago组)的BCL2L1表达量高于NC组(P<0.05),但尚低于control组(P<0.05),即上调miR-184将削弱阿霉素对BCL2L1表达的抑制作用。而miR-184拮抗剂转染组(Antago组)比NC组BCL2L1的表达显著降低(P<0.05),即下调miR-184将加剧阿霉素对BCL2L1表达的抑制作用。凋亡率与BCL2L1蛋白在骨肉瘤细胞中的表达呈现一种显著的正相关关系,其相关性系数达到80%(R=0.8069,P>0.01)。[结论]1、阿霉素上调miR-184在骨肉瘤细胞中的表达,提示miR-184可能参与阿霉素诱导耐药过程。2、上调骨肉瘤中miR-184的表达可削弱阿霉素的促凋亡作用,上调miR-184的表达则加剧阿霉素的促凋亡作用。3、BCL2L1存在miR-184的结合位点,miR-184通过上调BCL2L1参与阿霉素诱导耐药的过程。4、阿霉素抑制BCL2L1蛋白表达,其作用强于miR-184的上调作用。抗凋亡蛋白BCL2L1表达量与骨肉瘤凋亡率相关。5、miR-184通过上调骨肉瘤细胞中抗凋亡蛋白BCL2L1的表达,削弱阿霉素对BCL2L1的抑制,使骨肉瘤抗凋亡能力增强,减弱阿霉素对骨肉瘤细胞的杀伤效应,产生耐药；另一方面,miR-184通过下调骨肉瘤细胞中BCL2L1蛋白的表达,增强了阿霉素对BCL2L1的抑制,骨肉瘤抗凋亡能力减弱,提高阿霉素对骨肉瘤细胞的杀伤效应,逆转化疗耐药。