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第一部分PAO1外膜囊泡的提取的方法学建立及优化目的：建立并优化铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）外膜囊泡（out membrane vesicle,OMV）体外的提取及纯化方法，为研究OMV的生物学活性及诱导感染发生的机制奠定基础。方法：以铜绿假单胞菌标准株PAO1为模式菌，分别采用分别采取超滤浓缩法和Optiripe密度梯度超速离心分离法提取PAO1的外膜囊泡，负染电镜检测形态及纯度；BCA法检测两种方法提取的OMV蛋白浓度并计算OMV产量。结果：超滤浓缩法提取的OMV含有较多杂质，产量为21.3ug/1010个细菌，密度梯度离心提取的OMV无明显杂质存在，产量为48.7ug/1010个细菌。结论：超滤浓缩法和Optiripe密度梯度超速离心法均可用于提取PA的外膜囊泡，但Optiripe密度梯度离心法提取的OMV的产率和纯度均高于超滤浓缩法提取OMV。第二部分PAO1外膜囊泡的成分及生物学活性检测目的:初步检测PAO1的OMV中所含蛋白，建立OMV体内体外感染模型，检测OMV的生物学活性方法:用SDS-PAGE电泳初步鉴定OMV中所含蛋白条带，建立OMV感染人支气管上皮细胞BEAS-2B，ELISA检测炎性因子IL-6、IL-8的表达水平；通过滴鼻方式建立OMV感染Bablc小鼠模型，提取小鼠肺组织，HE染色观察其炎性变化；通过多粘菌素B抵抗实验，检测OMV对细菌的保护作用。结果:SDS-PAGE电泳结果显示PAO1的OMV中含有多种蛋白条带，主要为10-100KDa大小的蛋白；PAO1的OMV能显著诱导Base-2B细胞表达炎性因子IL-6、IL-8，刺激Balbc小鼠肺组织发生明显的炎性变化，且能帮助PAO1抵抗多粘菌素B的杀害。结论:PAO1分泌的外膜囊泡为一个含有多种蛋白的混合体，具有诱导宿主细胞产生炎性反应以及保护感染细菌抵抗周围不利环境等多种生物学活性。第三部分lasB对PAO1外膜囊泡的影响目的:探讨lasB基因对PAO1的OMV的形态、分泌量、及防御功能的影响。方法:PCR鉴定PAO1标准株和lasB缺陷的PAO1株，用Optiripe密度梯度超速离心法提取PAO1标准株和lasB缺陷株的外膜囊泡，负染电镜观察两种外膜囊泡的形态、BCA法检测OMV蛋白浓度，计算OMV产率，通过刚果红实验比较两种外膜囊泡弹性蛋白酶活性大小，建立OMV感染正常人外周血单个核细胞模型，通过计算细菌吞噬率检测OMV保护细菌抵抗单个核细胞吞噬的能力。结果:PAO1标准株和lasB缺陷株体外分泌的外膜囊泡形态一致，均为20-200nm的球形结构。与lasB缺陷株相比，PAO1标准株的OMV产率更高，所具有的弹性蛋白酶活性更强，且帮助细菌抵抗人外周血单个核细胞吞噬的能力更强。结论:lasB缺陷对PAO1体外分泌的外膜囊泡形态无影响，但lasB缺陷后，外膜囊泡的分泌量、所含弹性蛋白酶活性以及对细菌的保护能力均下降。