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舌癌(carcinoma of tongue)是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一,我国舌癌约占口腔恶性肿瘤的43.4%,居口腔癌之首。近几十年来,肿瘤治疗技术、设备迅速发展,各种外科治疗技术不断提高和完善,但舌癌患者五年生存率仍然不足60%。因此寻找新的治疗方法,以期提高舌癌患者的生存率和生存质量是十分必要的。
DNA复制是细胞周期、发育以及癌症形成当中的关键事件。真核生物中,为保证遗传物质精确传递到子代,一个细胞周期中DNA只能复制一次。DNA获得复制的能力是通过各种相关调控蛋白与DNA复制起始点顺序性结合而实现的。而细胞分裂周期蛋白(Cell division cycle protein 6,Cdc6)是DNA复制的首要因子,是形成复制前复合体(Pre-replication complex,Pre-RC)的主要成分,是确保细胞在细胞周期中只复制一次的重要因子。肿瘤细胞是典型的恶性增殖细胞,在无序增殖的同时伴随着DNA复制,在肿瘤细胞中存在高表达的Cdc6蛋白。本课题组前期研究结果显示:Cdc6在正常口腔粘膜中不表达或者低表达,而在癌前病变和舌癌组织中表达显著上调且表达量逐渐增强。这一理论依据为舌癌的早期诊断及治疗提供了新的思路。
本项目拟应用RNA干扰技术,靶向抑制舌癌细胞CAL-27中Cdc6的表达,观察Cdc6慢病毒载体对舌癌细胞CAL-27的敲减效能以及舌癌CAL-27细胞的增殖、凋亡等改变,初步探讨下调Cdc6表达抑制舌癌细胞增殖的分子机制,为舌癌的靶向分子治疗提供新途径。
方法:
1.实验分组:实验分四组,分别为CON、NC、KD1、KD2组。CON为正常目的细胞,未感染任何病毒的细胞组;NC为加阴性对照病毒感染的细胞组;KD1、KD2为加RNAi靶点病毒感染的细胞组;
2.慢病毒转染人舌癌细胞系CAL-27细胞,探索载体体外最佳转染滴度;
3.Real time PCR和Western Blot检测RNA干扰对CAL-27细胞Cdc6mRNA和蛋白表达水平的敲减效能;
4.流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;
5.MTT法检测CAL-27细胞生长水平。
结果:
1.RNAi慢病毒载体可成功感染舌癌CAL-27细胞株,最佳感染条件为MOI=50;
2.Real time PCR结果显示:KD1和KD2组在CAL-27细胞中对Cdc6基因的表达均有显著敲减效果。相对NC组,KD1、KD2组对Cdc6基因敲减效率分别为55.60%和64.38%(p<0.001);
3.Western Blot结果显示:感染靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体后,CAL-27细胞Cdc6蛋白表达水平明显下降,KD1、KD2组较NC组Cdc6蛋白表达降低分别为44.44%、66.67%(p<0.001);
4.流式细胞仪检测细胞周期显示:感染慢病毒载体后,KD1组、KD2组两组舌癌细胞CAL-27细胞凋亡率较NC组均有显著上升,分别为57.55%和83.81%(p<0.001),且KD2组细胞凋亡率较KD1组更高(p<0.05);
5.MTT法检测细胞生长水平:KD1及KD2组细胞较NC组生长水平受到抑制,KD1和KD2组细胞生长抑制率分别为34.78%和36.52%(p<0.001)。
结论:
靶向Cdc6慢病毒载体RNA干扰能有效下调舌癌CAL-27细胞中Cdc6mRNA和蛋白的表达水平,抑制CAL-27细胞的DNA复制,阻止舌癌细胞的增殖。Cdc6有望成为治疗舌癌的新靶点。