第一部分：大鼠肠道痢疾杆菌感染对PAR-2-AP舒张结肠平滑肌作用的影响及其机制目的PAR-2(Protease-Activated Receptor 2)属于G-蛋白偶联受体家族,广泛分布于消化道,参与调控消化道的运动、分泌和炎症反应。在肠道急性炎症期,PAR-2激动剂抑制大鼠远端结肠运动的作用减弱,但炎症后PAR-2激动剂的这种作用是否恢复到正常还不清楚。在制作肠道感染和炎症模型时大多数实验室都采用化学物质刺激或是寄生虫感染的方法,而最与临床接近的大鼠肠道细菌感染模型鲜见报道。因此,本研究采用了胃内灌注痢疾杆菌的方式制作大鼠肠道感染模型,探讨了肠道感染后不同时间点PAR-2舒张结肠平滑肌作用的改变及其机制。方法细菌准备弗氏志贺痢疾杆菌(Shigella flexneri)由山东大学齐鲁医院检验科提供。肠炎模型建立健康雄性Wistar大鼠(200-220 g),随机分为对照组和痢疾杆菌感染组(SF -treated)。实验前禁食,自由饮水。对照组给予高压处理的生理盐水1 ml灌胃,感染组给予1×108 CFU ml-1痢疾杆菌菌液1 ml灌胃。观察大鼠肠道感染后大便性状的改变、进食及体重增长情况,并分别于灌胃后第4天、第7天、第11天、第18天、第25天和第35天断头处死动物,取远端结肠做石蜡切片,HE染色。取远端结肠组织做MPO测定、肌条张力测定及Western blot检测。髓过氧化物酶活性测定远端结肠组织匀浆后,利用MPO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测结肠全层组织中MPO活性。HE染色4%多聚甲醛固定新鲜结肠标本,石蜡包埋,切片厚4μm。常规脱蜡,水化。苏木素染色,水洗后盐酸酒精分化,氨水返蓝,伊红染色,脱水,透明,中性树胶封片。结肠离体肌条张力记录肌条制备断头处死大鼠,快速取出2-3 cm远端结肠(距直肠1 cm)置于预冷的Krebs液中。沿肠系膜剪开肠腔,小心清理肠腔。沿肌纤维走向取结肠组织,制作纵行肌条和环形肌条(4 mm×10 mm)。将肌条分别置于盛有5 ml Krebs液的玻璃浴槽内,持续供给95%O2和5%CO2并恒温37℃,每15 min更换一次Krebs液。待肌条自发收缩稳定以后开始实验。实验步骤加入50μl不同浓度的PAR-2激动肽段(PAR-2 activating peptide, PAR-2-AP)或无活性的PAR-2反向肽段(PAR-2 reverse peptide, PAR-2-RP),使终浓度为1-10μM,观察PAR-2激活后结肠肌条自发收缩活动的改变。观察阻断剂TTX的作用时,先加入50μl TTX溶液使终浓度为10μM孵育30 min,再加入不同浓度的PAR-2-AP或PAR-2-RP。免疫组织化学远端结肠冰冻切片用磷酸盐缓冲液冲洗3次,3%过氧化氢封闭10 min以封闭内源性过氧化物酶,PBS冲洗,5%正常兔血清封闭15 min后,滴加羊多克隆抗PAR-2抗体(1：50,50μl)后4℃环境中孵育过夜,然后用PBS冲洗,加入辣根酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的抗山羊IgG工作液后室温孵育30 min,用DAB显色,苏木素复染,盐酸酒精分化,氨水返蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。Western blot将结肠组织匀浆后,4℃离心,取上清液进行蛋白定量。与sample buffer按照1：1比例混匀,煮沸5 min使蛋白变性。10% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel)电泳,转膜,室温下5%脱脂奶粉封闭90 min,加入PAR-2一抗(sc-8205,1：2000)4℃孵育过夜。用TTBS冲洗3次,每次5 min后,在室温下加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：80000)孵育1hr,用TTBS冲洗3次后,ECL显影。统计分析在离体肌条实验中,以肌条的平均张力为观察指标,加PAR-2-AP或PAR-2-RP之前3 min的平均张力为基础值,标准化为100%,加入PAR-2-AP或PAR-2-RP之后不同时间点的平均张力为效应值,效应值与基础值的比值为统计指标。在western blot实验中,对照组目的蛋白的灰度值标准化为100%,痢疾杆菌处理组目的蛋白的灰度值与对照组目的蛋白的灰度值之比为统计指标。所有数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示,采用单因素方差分析和t检验进行统计学处理,以P＜0.05为显著性差异界值。结果1.大鼠在痢疾杆菌(1×108 CFU/ml,1 ml)灌胃后第3-4天陆续开始出现腹泻、稀便,在7-11天最严重,第18天后消失。HE染色显示在第4天-11天粘膜水肿,粘膜下中性粒细胞浸润。与对照组相比,感染组大鼠体重增长只在第11天明显低于对照组；结肠组织MPO活性从第7天开始增加,到第11天达到最高,第18天恢复正常。2.PAR-2-AP(1-10μM)抑制大鼠远端结肠纵行肌条和环形肌条自发性收缩且有一定的剂量-反应关系,该抑制效应在加入PAR-2-AP 2 min内最明显。同样剂量的PAR-2-RP不影响各肌条的自发性收缩活动。加入三种浓度(终浓度分别为1,5,10μM)的PAR-2-AP后2 min,远端结肠纵行肌条的张力分别下降8.52±1.37%(P< 0.05 vs. RP)、13.77±2.91%(P< 0.05 vs. RP)和15.27±4.04%(P<0.05 vs. RP),远端结肠环形肌条的张力分别下降10.29±2.71%(P<0.05 vs. RP)、12.95±3.04%(P< 0.05 vs. RP)和16.11±3.93%(P<0.05 vs. RP),加入TTX(10μM)预处理30 min不影响PAR-2-AP对结肠肌条自发性收缩活动的抑制效应。3.大鼠痢疾杆菌感染后结肠远端环形肌条对PAR-2-AP舒张作用的敏感性降低,远端纵行肌条敏感性没有明显改变。4.免疫组织化学证实PAR-2表达于结肠的环形肌、纵行肌以及肌间神经丛,痢疾杆菌灌胃后第18天,环形肌上PAR-2表达下降。5. Western blot检测结果表明痢疾杆菌感染大鼠后第11-35天远端结肠PAR-2的表达量降低。结论1.痢疾杆菌灌胃可以引起远端结肠的感染和炎症反应,远端结肠局部炎症第11天最明显,第18天消失2. PAR-2-AP引起结肠平滑肌发生舒张,该效应是由平滑肌细胞上的PAR-2介导的。3.痢疾杆菌感染大鼠后结肠远端环形肌对PAR-2-AP的敏感性降低,这种改变可能与痢疾杆菌感染下调环形肌上PAR-2表达有关。第二部分痢疾杆菌感染后空肠肠系膜传入神经敏感性的改变目的肠易激综合征(Irritable Bowel Syndorme, IBS)是最常见的功能性肠道疾病,内脏高敏感性是IBS的重要临床表现。部分IBS病人发病前有肠道感染的病史,这类IBS被称为感染后IBS (post infections IBS, PI-IBS)。目前常用的PI-IBS动物模型是用化学物质刺激和寄生虫感染造成肠道炎症,本研究拟采用痢疾杆菌灌胃造成大肠炎模型,研究痢疾杆菌感染后空肠肠系膜传入神经对机械和化学刺激敏感性的改变。方法1.肠炎模型建立同第一部分,取空肠组织做HE染色和髓过氧化物酶活性测定,方法同第一部分2.肠系膜传入神经放电记录技术2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后小心取出带有肠系膜血管的空肠肠管2-3 cm,置于预冷的Krebs液中。冲洗干净肠腔内容物后固定于灌流浴槽。蠕动泵与外灌流系统相连,灌流浴槽的内槽,灌流速度为10 ml min-1;微量注射泵与内灌流系统相连,灌流肠腔,灌流速度为10 ml h-1可,外灌流的Krebs液持续供给95%O2和5%CO2,保持内槽恒温33℃。40倍镜下分离出肠系膜神经并从中枢端剪断,游离一段与神经同样粗细的结缔组织,肠系膜神经中枢端和结缔组织分别悬挂于两根直径为0.1 m的铂金电极上。电信号通过生物电放大器(1902,CED,Cambridge,英国)放大10000倍后经过模／数转换器(Micro1401,CED,Cambridge,英国)后输入计算机,通过Spike 2(Version 5.20,CED,Cambridge,英国)记录并分析神经纤维动作电位。4.实验步骤4.1化学刺激时,待肠系膜传入神经自发性放电稳定15 min后,关闭外循环泵,内浴槽内加入药物作用5 min后,打开外循环泵冲洗。4.2机械刺激时,待自发性放电稳定15 min后,保持肠腔内灌流速度30ml h-1并关闭内灌流出口,使肠腔内压力升高60 mmHg.记录肠神经放电活动的变化。统计分析每3 s对神经放电频率进行一次累计,在某一特定时间段内放电次数最多的3 s期间的放电频率称为peak放电。采取加药前120s内的神经peak放电为baseline,在化学性刺激时,加药后0-30 s、30-60 s、60-90 s及90-120 s的peak放电减去baseline为统计指标。在机械扩张刺激时,每升高10 mmHg后肠神经peak放电减去basel ine为统计指标。所有数据采用均数±标准误(mean±SEM)表示,采用单因素方差分析和t检验进行统计学处理,以P＜0.05位显著性差异界值。结果1.空肠段肠系膜传入神经呈现规律的自发放电,平均放电频率为8±2 spikes／sec。2.痢疾杆菌灌胃处理后不同时间点空肠段没有观察到炎症反应,与对照组大鼠相比,SF-treated组大鼠空肠髓过氧化物酶活性没有明显改变。3.灌流液中加入5-HT后,正常和痢疾杆菌感染大鼠空肠段肠系膜传入神经放电都明显增加；与对照组相比,灌胃处理后第25天,大鼠空肠段肠系膜传入神经电活动对5-HT的反应性没有明显改变。4.机械扩张刺激引起正常和痢疾杆菌灌胃大鼠空肠段肠系膜传入神经放电明显增加；与对照组相比,在痢疾杆菌灌胃处理后第25天,空肠段肠系膜传入神经对机械扩张刺激的敏感性增加。5.缓激肽兴奋正常和痢疾杆菌灌胃大鼠空肠段肠系膜传入神经自发放电活动,与对照组相比,在痢疾杆菌灌胃处理后第25天,大鼠空肠段肠系膜传入神经对缓激肽刺激的敏感性明显增加。结论痢疾杆菌灌胃处理后第25天,空肠肠系膜传入神经对Bradykinin和机械刺激的敏感性增高,对5-HT的刺激没有明显改变,说明肠道痢疾杆菌感染导致了空肠交感传入神经的高敏感性。