玉米是最早利用杂种优势的作物,利用雄性不育系生产杂交种子,可以提高种子纯度和降低生产成本。但是,目前对玉米细胞核雄性不育的败育机制还不十分清楚,从而限制了其生产应用。本研究以玉米K305ms为材料,利用iTRA Q技术构建花药发育3个不同时期的可育和不育花药蛋白质表达谱,并对差异表达蛋白进行比较分析。通过GO、COG和P athway注释和富集分析,挖掘与育性相关的功能蛋白和关键代谢途径。结合蛋白免疫技术、荧光定量技术和气相-质谱联用技术验证,探讨K305ms的败育机制,为进一步研究利用奠定基础。主要结果如下：1.利用iTRAQ技术共鉴定到肽段27607个,蛋白质6606个。GO分析表明这些蛋白主要分布于细胞和细胞内器官上,以结合活性和催化活性蛋白为主,主要参与细胞的代谢过程和细胞过程；COG功能分类显示除通用功能外,大多数为翻译后修饰、分子伴侣、蛋白质转换、翻译、核糖体结构和生物合成蛋白；pathway代谢途径注释发现304条代谢通路,主要集中在碳水化合物代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、细胞物质的跨膜运输与信号传递及次生代谢物代谢途径。聚类分析显示,在花药发育早期和后期,不育和可育花药蛋白表达模式相似,而中期表达模式则不同,暗示中期(减数分裂期)可能是败育关键时期。2.比较筛选结果,在可育和不育花药3个发育时期分别鉴定出175、215和426个,共721个显著的差异表达蛋白。这些蛋白在早期可育比不育上调表达23个,下调表达24个；中期上调16个,下调49个;后期上调59个,下调12个。GO富集分析表明,主要包括转运活性和电子载体活性蛋白等,参与细胞的代谢过程、生长发育和信号转导。COG功能分类显示翻译后修饰、分子伴侣和蛋白质转换差异表达蛋白居多。pathway富集分析表明,差异表达蛋白涉及198条代谢途径,根据相关蛋白富集和差异表达的持续性,推测碳水化合物和能量代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸链延长等途径可能是导致败育的通路之一。3.筛选出Hsp70、ADGP和ATP三个蛋白作为一抗,以β-Actin为内参抗体采用Western blot免疫表达分析结果显示,Hsp70在花药发育过程中表达量差异不显著,ADGP在花药发育后期表达量差异显著,ATPβ在花药发育中期表达量差异显著,与iTRAQ结果趋势一致。ATPβ在能量代谢中具有重要的作用,在发育中期不育花药几乎是痕量。不育花药发育中期ATPp含量低于可育花药,可能导致中期能量供应不足,影响正常减数分裂。4.选取7个相关差异表达蛋白对应的基因设计特异引物,通过qRT-PCR反应检测3个时期可育和不育花药的转录水平表达。结果表明,转录本水平与其对应的蛋白质表达水平基本一致。代谢通路分析发现,这些蛋白主要功能是在脂肪酸生物合成和脂质代谢途径中发挥重要作用,通过影响脂肪酸链延长和降解影响脂类物质合成。脂类物质的减少可能会造成外壁的降解,花粉粒无法形成导致败育。5.通过气相-质谱联用分析技术,测定3个时期可育和不育花药的蜡质和角质含量,发现3个时期不育花药蜡质含量略低于可育花药,差异均不显著；角质含量前期和后期不育花药低于可育花药,而中期可育花药低于不育花药,差异均达极显著水平。部分长链角质单体的含量不育花药极显著低于可育花药。进一步验证了脂肪酸链延长和脂质代谢异常可能导致玉米雄性不育。6.推测玉米K305ms败育原因可能是由于前期和中期碳水化合物和能量供应不足,导致花药发育早期相关基因转录、翻译及核糖体合成受到抑制,造成花粉母细胞减数分裂异常；中后期相关代谢通路受阻,尤其是脂肪酸合成和脂质代谢中脂肪酸链的延长不能正常进行,导致花药绒毡层发育异常；绒毡层发育异常导致花药退化,减数分裂异常最终不能形成功能花粉。