论文部分内容阅读
大量研究表明:氧化应激与心血管疾病、癌症、糖尿病及其并发症等多种慢性疾病的发生、发展密切相关,应用抗氧化治疗可逆转氧化应激对组织的损伤,从而阻止或延缓各种疾病的发生、发展。本课题以筛选得到的高活性肽为研究对象,用高糖孵育血管平滑肌细胞(VSMCs),进一步确证小肽在细胞水平的生物抗氧化性,并探讨小肽对高糖孵育的VSMCs增殖和凋亡的影响。主要研究内容及结果如下:1.体外化学法评价小肽AREGEM的抗氧化性。以筛选出的麦胚抗氧化肽序列AREGETWPG为基础,通过对肽序列进行修饰,得到MAREGETVVPG、MAREGE、AREGEM这几条序列。采用基于氢原子转移反应机制和电子转移反应机制的体外化学法,对这几条小肽的抗氧化活性进行了初步的评价。筛选出了高活性的抗氧化肽序列:AREGEM。2.进一步验证小肽AREGEM在细胞水平的生物抗氧化活性。以肽序列AREGEM为研究对象,采用体外培养VSMCs,研究小肽对高糖诱导的VSMCs内活性氧(ROS)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响。在高糖中加入不同浓度的抗氧化肽后,与高糖组相比,可以显著降低细胞内ROS的水平,提高VSMCs中的T-AOC、GSH-Px和SOD酶水平,显著降低细胞中MDA的水平。说明抗氧化肽可以通过增加机体清除自由基的能力、减少脂质过氧化反应和脂质过氧化产物的生成发挥其抗氧化作用,从而维持细胞的稳定状态,发挥其保护细胞的功能。3.从增殖率和细胞周期等方面来探究小肽AREGEM对高糖孵育的VSMCs增殖的影响。MTT法证明一定浓度的抗氧化肽AREGEM可以保护细胞,有效抑制高糖引起的VSMCs增殖过快。尤其当肽的浓度为45μM时,VSMCs的增殖率降到了 104.41±4.36%(p<0.01),达到了和对照组一致的水平。同时,低浓度的抗氧化肽AREGEM对细胞生长没有任何影响(p>0.05)。实验结果表明抗氧化肽对VSMCs既无促进生长作用,也无抑制生长作用。碘化丙啶(PI)单染法证明高糖环境可以使G0/G1期的VSMCs数目减少,进入S期的细胞数目明显增多。加入不同浓度(15 μM和45 μM)的小肽处理后,实验组被阻滞于Go/G1期的细胞上升,而S期的细胞数目减少,增殖指数也显著降低。实验结果表明小肽AREGEM主要是抑制高糖诱导的Go/G1期细胞进入S期,从而抑制细胞增殖的进程。4.探讨了小肽AREGEM对高糖孵育的血管平滑肌细胞凋亡的影响。采用荧光显微镜观察结合现代凋亡检测技术,检测细胞的凋亡。在此基础上,选取与细胞凋亡相关的蛋白或基因,采用Western Blotting,从生物分子水平及免疫学角度,来研究抗氧化肽对高糖抑制VSMCs凋亡的影响。Hoechst 33258染色法和AnnexinV-FITC/PI双染法实验结果都表明:高糖环境抑制VSMCs的凋亡,加入小肽处理后,可以减弱这种抑制作用。小肽可以减弱高糖环境抑制VSMCs的凋亡,可能与降低细胞内Caspase-3的活性与降低细胞内Bcl-2/Bax的比值有关。此外,由于高糖环境使细胞内ROS的水平增高,导致AKT的Ser473位点磷酸化水平增高;加入小肽后,也可以降低高糖孵育的VSMCs内AKT的磷酸化水平。