华南地区猪圆环病毒3型的流行病学调查及ELISA检测方法的建立

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猪圆环病毒3型(Porcine Circovirus 3,PCV3)是近年新发现的圆环病毒,研究发现PCV3可能与猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis nephropathy syndrome,PNDS)和猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)等症状有关。北美、亚洲、欧洲和南美洲的多个国家和地区先后报道了PCV3的存在,其中我国PCV3的流行情况十分严重,多个省份和地区均存在PCV3的流行情况,并且PCV3的感染率有逐年升高的趋势,对PCV3流行病学和诊断方法的研究具有重要意义。为了解PCV3在我国华南地区的流行情况,本研究从2016年12月到2018年2月期间,从广东、广西、海南、福建、江西和湖南的203家规模化猪场采集1319份病料,利用PCR技术检测PCV3的流行情况,并对PCV3阳性病料进行全基因组测序分析。结果表明,样品阳性率为31.61%(417/1319),猪场阳性率为44.83%(91/203)。从病料中测得的22株PCV3毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%100%,与国内外其他毒株的同源性在98.4%98.8%之间。PCV3 Cap基因遗传进化分析显示遗传进化树可以分为PCV3、PCV3b和PCV3c三个分支,其中毒株HuN-CS和GD-ZQ-1属于以美国毒株US/MO2016为代表的PCV3a分支,毒株GD-SH-4处在PCV3b分支,其余19个毒株属于PCV3c分支。本研究表明PCV3广泛存在于华南地区的猪群中,其基因组在不断进化。本研究利用原核表达的方法成功表达出截短的PCV3 Cap蛋白,并利用PCV3 Cap蛋白作为抗原成功建立了检测PCV3抗体的间接ELISA检测方法,确立了如下最佳反应条件:以200 ng/孔包被酶标板,在4℃条件下包被过夜,使用5%脱脂乳作为封闭液在37℃条件下封闭2 h,待检血清1:50稀释后与酶标板反应45 min,二抗1:40000稀释,反应时间为25 min,使用TMB显色液在25℃条件下显色10 min,最后用2M H2SO4终止反应,待检血清OD 450nm值≥X+3SD=0.213时判断为PCV3阳性,待检血清OD 450nm值≤X+2SD=0.197时判断为PCV3阴性,介于两者之间为可疑。本研究建立的ELISA抗体检测方法具有良好的特异性和重复性,适用于用于大规模血清学检测。对PCV3的血清学调查显示,随日龄的增加PCV3的抗体阳性率逐渐升高,种公猪和母猪的抗体阳性率高达95%以上,表明PCV3在华南地区的流行情况十分严重。本研究为华南地区PCV3的流行病学研究提供了较为丰富的参考数据,为PCV3ELISA试剂盒的研制奠定了基础,有助于PCV3防控措施的研究和开展。
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