精神病是由多种因素引起的难治性精神疾病,目前,药物治疗是控制病情进展的有效手段。抗精神病药物分为典型性抗精神病药物和非典型性抗精神病药物。典型抗精神病药的代表有氯丙嗪、舒必利等;非典型抗精神病药物的代表有氯氮平、奥氮平、利培酮等。因典型抗精神病药物在治疗中伴随较严重的椎体外系反应,已逐步被非典型抗精神病药物取代。非典型抗精神病药物对精神疾病的阴性和阳性症状均有较好的改善作用,但在长期治疗中会引起发生代谢综合征。关于非典型抗精神病药物引起脂代谢异常的机制已有较多报道,但由于脂代谢异常机制复杂,目前尚未确定主要机制,临床上也没有有效对策。左旋肉碱(L-Carnitine,L-Car)是体内重要的生理性物质,也是脂肪酸代谢中的一种关键物质,可介导脂肪酸由细胞质进入线粒体进行β氧化供能。人体中75%的L-Car来自外源性摄取,主要包括L-Car含量较高的动物性食物;内源性合成的L-Car只占体内L-Car的约25%。正常情况下,人体血浆L-Car浓度维持在约50μM的稳态水平。L-Car经肾小球滤过,但可被肾脏重吸收,未被重吸收的L-Car经尿液排泄。因L-Car是高极性的离子型化合物,其进入细胞需要转运体的介导。OCTN2对L-Car具有极高的亲和力,在肾脏、肝脏、肌肉等组织高表达,是介导肾脏L-Car重吸收的主要转运体。当OCTN2介导的L-Car重吸收受到药物抑制或原发性OCTN2表达缺失导致体内L-Car水平降低时,可能会引起脂质氧化异常、低血糖症等代谢性疾病。此外,肝脏是脂肪酸氧化的主要器官之一,长链脂肪酸进入肝脏内氧化供能需要一系列蛋白参与,表达在细胞膜上具有脂肪酸转运功能的CD36、FATP2/5可将长链脂肪酸转运进入细胞;位于线粒体膜上的CPT1/2协助脂肪酸进入线粒体进行β氧化。因此,如果药物对上述蛋白表达产生影响,也会扰乱脂肪酸氧化平衡,导致脂肪肝等后果。基于上述分析,我们选择非典型抗精神病药物中的氯氮平,考察其对OCTN2功能及表达的影响,及其与氯氮平引发的脂代谢异常的关系;同时考察氯氮平对肠道及肝脏脂质氧化和转运相关蛋白表达的调控,以阐明氯氮平致脂代谢异常的可能机制,为改善氯氮平引起的脂代谢异常提供理论和实验依据。1.氯氮平对OCTN2功能抑制和表达调控本章通过多种研究模型证明了氯氮平对OCTN2介导的L-Car摄取的直接抑制作用,以及对肾脏OCTN2表达的下调作用。首先,应用本实验室已经构建成功的稳定表达人OCTN2的马丁达比狗肾上皮(MDCK-hOCTN2)细胞,采用米屈肼和氘代左旋肉碱(d3-L-Car)两种底物,考察非典型抗精神病药物对OCTN2的抑制能力。结果显示,所考察的药物对OCTN2有不同程度的抑制,其中氯氮平和奥氮平对MDCK-hOCTN2细胞摄取d3-L-Car的IC50值分别为1.78和1.06 μ M;小鼠原代肾小管上皮细胞和人肾小管上皮细胞系(HK-2)上的摄取抑制实验也表明,100μM氯氮平使d3-L-Car在细胞内的积聚降低至溶剂对照的约50%;在HK-2细胞上研究发现,氯氮平可下调OCTN2mRNA表达水平,该调控可能通过下调PPARα表达而实现;进一步在小鼠体内证明,单次腹腔注射和连续3周灌胃氯氮平均显著下调肾脏中Octn2mRNA和蛋白表达水平。2.氯氮平对小鼠体内L-Car稳态及脂肪酸氧化的影响在上一章研究的基础上,本章研究氯氮平对体内L-Car稳态及脂肪酸氧化的影响。首先考察小鼠单次腹腔注射氯氮平和连续3周,每天1次灌胃氯氮平后,尿液中L-Car排泄量的变化。结果显示,单次和连续3周灌胃后,小鼠尿液中L-Car排泄量均显著增加,连续灌胃3周后,低(12.5mg/kg)、中(25mg/kg)、高(50mg/kg)剂量组尿液排泄分别是溶剂对照组的2倍、2.5倍和3倍。测定血浆和组织中L-Car水平发现,单次腹腔注射后中(25mg/kg)、高(50mg/kg)剂量组小鼠,血浆L-Car水平降低约30%,连续灌胃50mg/kg氯氮平小鼠,其血浆L-Car水平降低约40%;连续灌胃3周,小鼠肝脏、肾脏和骨骼肌L-Car水平有所降低,提示氯氮平可通过减少L-Car重吸收,增加L-Car尿液排泄,降低体内L-Car水平。连续灌胃50mg/kg氯氮平3周,末次给药6小时后,肝脏和肾脏中氯氮平浓度高达10 μmol/g和30 μmol/g,远高于氯氮平对OCTN2抑制的IC50,提示氯氮平可通过直接抑制OCTN2功能和下调OCTN2表达,影响L-Car的重吸收。连续3周灌胃50mg/kg氯氮平,小鼠肝脏甘油三酯和总胆固醇水平分别升高1.5倍和2倍,小鼠肝脏切片油红O染色结果也证明3个剂量下,氯氮平均能使小鼠肝脏脂质水平升高。为考察外源性补充L-Car是否可以改善氯氮平所致的肝脏脂代谢异常,我们在小鼠连续4周灌胃氯氮平(25mg/kg)的同时,给予不同剂量的L-Car(40 mg/kg～1g/kg),结果表明,小鼠血浆和组织中的L-Car缺乏得到明显改善,肝脏甘油三酯和总胆固醇水平显著低于单给氯氮平组,其中1g/kg L-Car组可恢复到空白对照组(未给氯氮平和L-Car)水平,小鼠肝脏切片油红O染色结果亦显示,L-Car可以明显改善氯氮平所致的肝脏脂代谢异常。3.氯氮平对肠道、肝脏脂肪酸转运和氧化关键蛋白的调控为探究氯氮平能否通过其他途径影响肝脏脂肪酸氧化,我们考察了氯氮平对肠道和肝脏中与脂肪酸转运和氧化相关蛋白的表达变化。结果显示,连续3周灌胃氯氮平(50mg/kg)可上调小肠CD36(1倍)、FATP4(0.5倍)和NPC1L1(1倍)的mRNA表达水平;HepG2细胞经20μM氯氮平孵育24小时,以及小鼠连续灌胃氯氮平(50mg/kg)3周,FATP2和FATP5 mRNA及蛋白表达上调,连续3周灌胃氯氮平可下调小鼠肝脏CPT1A的mRNA表达。因此,氯氮平可能通过增加肠道和肝脏的脂质摄取,引起肝脏脂肪酸氧化效率降低。