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骨肉瘤(OS),最常见的原发性骨恶性肿瘤之一,在癌症中发病率为第八位,每年每百万人中有4.4人发病,好发生在长骨的干骺端。在过去30年,尽管骨肉瘤患者5年生存率从20%提升到75%,但是有很大一部分患者对化疗不敏感,即使手术切除原发灶应用大剂量化疗,仍然存在较高的复发和转移风险。究骨肉瘤转移机制在骨科和相关学科一直是研究重点。MG-63细胞是一个具有高转移潜能的骨肉瘤细胞系。目前,还没有发现关于人骨肉瘤高转移或未转移的MG-63细胞系的转移机制的研究。miRNAs是一类进化上保守的内源性单链非编码小RNA。miRNAs在细胞增殖、发育、分化、凋亡、侵袭、应激及死亡过程中发挥着重要作用。越来越多的证据表明,许多miRNAs的异常表达与人类疾病有关,包括癌症。实际上,大量研究证实,miRNA表达异常出现在多种肿瘤中,并且作为肿瘤抑制基因和癌基因发挥作用。miR-130b已经被证实是一种重要的肿瘤调节基因,在多种人类恶性肿瘤中存在表达异常。以往研究通过miRNA高通量测序发现miR-130b在骨肉瘤细胞中表达升高。前期实验发现裸角质膜同源2(NKD2)是miR-130b的一个潜在的靶点。近年,NKD2被报道通过抑制Wnt信号通路抑制骨肉瘤的生长和转移。因此,我们假设miR-130b可能通过调控NKD2的表达作用于骨肉瘤。1.建立和分析不同转移能力的骨肉瘤细胞亚系目的建立不同转移能力的骨肉瘤细胞亚系,为骨肉瘤转移机制的研究提供新的细胞模型。方法对MG-63细胞系进行有限稀释,得到6个MG-63细胞亚系。体外侵袭实验,细胞电泳率检测,细胞增殖率检测以及软琼脂克隆形成试验来分析各种细胞亚系的转移性特点。结果体外侵袭实验,细胞电泳率检测,细胞增殖率检测以及软琼脂克隆形成试验结果显示,A2、A3和A16细胞亚系侵袭能力明显高于A1、A6和A20细胞亚系。A2、A3和A16细胞亚系三组之间无统计学差异,A1、A6和A20细胞亚系三组之间无统计学差异(P>0.05),而A2、A3和A16组与A1、A6和A20之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功建立了不同转移能力的骨肉瘤细胞亚系,可用于骨肉瘤转移机制的研究。2.miR-130b以NKD2为靶点通过调节Wnt信号通路从而促进骨肉瘤细胞增殖、抑制其凋亡目的分析miR-130b以NKD2为靶点通过调节Wnt信号通路从而促进骨肉瘤细胞的增殖。为骨肉瘤发生发展提供新线索,为骨肉瘤治疗提供新的潜在治疗靶点。方法实时定量PCR、Western Blot、MTT和流式细胞技术是用来分析miR-130b对不同转移能力的骨肉瘤细胞亚系的影。荧光素酶报告实验被用来验证NKD2是miR-130b的直接靶点。结果在骨肉瘤细胞亚系中,miR-130b的mRNA和蛋白表达上调,NKD2的mRNA和蛋白表达下调。miR-130b抑制剂能抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进其凋亡。NKD2是miR-130b的直接靶点,miR-130b通过与NKD2结合调控骨肉瘤细胞的增殖和凋亡。miR-130b和NKD2通过调控Wnt信号通路影响骨肉瘤细胞的增殖和凋亡。结论miR-130b以NKD2为靶点通过调节Wnt信号通路从而促进骨肉瘤细胞的增殖,抑制其凋亡。