背景及目的肝纤维化是慢性肝病的一种常见的病理变化，其主要特征是细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)在肝内的积累。受到慢性肝损伤因子刺激后，肝星状细胞(hepatic stellatecell，HSC)从静止状态活化为能表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、产生大量ECM的肌成纤维样细胞，从而促进肝纤维化。转化生长因子(Transforming growth factor β1, TGF-β1)一直被认为是一个最有力的促进肝纤维化的细胞介质，但是由于它效应复杂，完全阻断可能会产生严重的副作用。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)作为TGF-β1直接下游介质，其作用较为单一，与TGF-β1相比，其生物学效应更局限于纤维化的发生，近年来逐步受到关注。CTGF不仅可介导原代HSC的活化、增殖和迁移，还能促进活化HSC分泌ECM。研究表明抑制CTGF的表达可以明显抑制HSC的活化、增殖，减少ECM的合成。CTGF在正常肝组织表达水平很低，在纤维化肝脏，其表达水平明显增高，与肝纤维化的发生发展密切相关。通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)阻断CTGF策略取得了良好的抗肝纤维化作用。目前，RNA干扰技术的主要效应分子为siRNA、short hairpin RNA(shRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)。人工microRNA(artificial microRNA，amiRNA)是指利用天然内源性miRNA的骨干生成成熟miRNA，有效沉默目的基因。实验表明amiRNA较siRNA或shRNA更安全、有效。然而，面临的挑战是如何有效地将amiRNAs传递到靶器官。近几年大量研究报道超声靶向微泡破坏(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)能有效、安全增强基因转染效率并具有高度的靶向性，是一种新型的基因传递方法。微泡可作为基因的载体，在超声辐照作用下，微泡破坏，基因可在靶区释放，同时产生的空化效应增加细胞膜的通透性，促进基因进入细胞。但是目前普通微泡存在携带基因不足的缺陷。研究表明将纳米脂质体连接到微泡的表面，可以提高微泡的基因携带量。因此，本研究模仿内源性miRNA构建针对CTGF的人工microRNA质粒载体，观察在体外对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)中CTGF的沉默效果；探讨高机械指数诊断超声联合微泡对肝脏通透性的影响及介导基因转染的优化条件；采用生物素-亲和素-生物素连接的方法，将载基因生物素化阳离子脂质体与生物素化微泡耦联制备出一种新型载基因微泡载体；采用新型超声微泡载体介导靶向CTGF的人工microRNA，利用UTMD技术介导其体内转染，旨在探讨其体内抑制大鼠肝CTGF基因表达的可行性及用于抗肝纤维化的有效性。方法1.靶向CTGF的人工microRNA质粒载体的构建和干扰筛选：模拟内源性miRNA，设计四对靶向大鼠CTGF的miRNA前体序列，同时设计一对阴性对照序列，构建到pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR质粒载体中，并对重组质粒进行测序。重组质粒分别命名为miRNA-CTGF-1，miRNA-CTGF-2，miRNA-CTGF-3，miRNA-CTGF-4和miRNA-CTGF-Scramble。用脂质体转染法将以上质粒分别转染入大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞中，同时设未进行质粒转染的空白对照组，转染24h后倒置荧光显微镜观察转染效率，转染48h后荧光定量PCR法检测HSC-T6中CTGF mRNA表达情况，72h后Western Blot法检测CTGF蛋白表达情况，从而筛选出最高效沉默CTGF基因表达的干扰质粒载体。2.高机械指数诊断超声联合微泡对大鼠肝脏通透性的作用及安全性研究SD雄性大鼠104只随机分为四组：超声联合微泡组(US+MB组)、单纯超声组(US组)、单纯微泡组(MB组)、对照组(control组)。采用频率为1.5/3.2MHz，机械指数(MI)=1.0的高机械指数诊断超声进行辐照。用伊文氏蓝(Evans blue，EB)为示踪剂检测高机械指数诊断超声联合微泡对正常大鼠肝血管通透性的影响，激光共聚焦显微镜直观观察不同处理组EB在大鼠肝组织内的分布，硝酸镧示踪法透射电镜观察肝细胞膜通透性的变化。检测处理前及处理后0.5h、12h、24h血中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)变化及肾尿素氮(blood ureanitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CREA)变化。取处理后0.5h、1w肝、肾组织，苏木素伊红染色进行病理检测。3.制备载基因阳离子脂质体-微泡在自制“脂氟显”微泡基础上，以冷冻干燥法制备生物素化微泡和生物素化阳离子脂质体。将生物素化阳离子脂质体与质粒在室温下混合孵育30min，即制成载基因的生物素化阳离子脂质体。琼脂糖凝胶电泳观察不同体积比孵育质粒与阳离子脂质体的电泳情况。采用生物素-亲和素连接的办法，耦联生物素化微泡和载基因的生物素化阳离子脂质体制备载基因的新型超声微泡。激光共聚焦显微镜观察新型微泡形态及连接情况。分光光度计检测新型超声微泡载基因率。4.超声联合新型超声微泡介导CTGF人工microRNA抗肝纤维化的实验研究64只SD大鼠随机分为8组，第1组予生理盐水腹腔注射作为正常对照组，第2组为二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)损伤建立的大鼠肝纤维化模型对照组。第3组为阴性序列对照组即载阴性序列对照质粒阳离子脂质体-微泡+超声组，第4-8组设为有效序列治疗组，分别为载基因阳离子脂质体-微泡(载基因新型微泡)+超声组、质粒+“脂氟显”微泡组+超声组、载基因新型微泡组、质粒+“脂氟显”微泡组、单纯质粒组。治疗结束后取肝组织用HE染色、Masson染色法和Sirius胶原染色观察肝脏的病理变化。实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测CTGF mRNA及蛋白表达水平。免疫组织化学检测TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平。结果1.成功构建和筛选了靶向CTGF基因的miRNA重组质粒构建了4个靶向CTGF基因的miRNA重组质粒，其测序结果与序列设计一致。质粒转染大鼠HSC-T6细胞后，荧光显微镜下观察到大于80%的HSC-T6细胞中观察到绿色荧光，说明质粒转染成功，而且高效表达。荧光定量PCR和Western blot结果表明，与空白对照和阴性序列质粒组比较，miRNA-CTGF-1、miRNA-CTGF-2、miRNA-CTGF-3、miRNA-CTGF-4干扰质粒均对CTGFmRNA和蛋白有明显抑制作用，其中以miRNA-CTGF-4干扰效果最为显著。2.高机械指数诊断超声联合微泡能安全有效提高肝区微血管通透性、肝细胞的通透性以及介导基因靶向转染肝组织内EB含量检测结果显示单纯超声组和单纯造影剂组与对照组比较没有统计学差异，超声联合微泡组与其余三组比较均有显著统计学差异。激光共聚焦显微镜下可见与其余三组比较，超声联合微泡组肝组织内可见明显增强的红色荧光，在肝细胞内可以清晰显示蓝色的胞核周围有明显的红色荧光围绕。硝酸镧电镜示踪结果显示对照组及单纯造影剂组及单纯超声组镧颗粒主要分布于肝窦毛细血管内及肝细胞间隙，未进入肝细胞内；超声联合微泡造影剂组，镧颗粒除了分布于肝窦毛细血管内及肝细胞间隙外，还可见镧颗粒进入到肝细胞内，但大部分呈颗粒状沉积于线粒体外，未进入线粒体内。超声联合微泡组处理后血清ALT和AST有一过性升高但很快恢复正常，肌酐、尿素氮虽略有波动，但其变化无统计学意义。病理结果显示超声联合微泡造影剂组处理0.5h后可见肝细胞变性，但是一周后恢复正常，对肾组织无明显影响。3.成功制备高载基因的新型微泡载体生物素化的阳离子脂质体平均粒径约120nm，平均表面电荷约50mV。当阳离子脂质体与质粒DNA体积比大于等于6:1时，质粒DNA可被完全阻止。激光共聚焦显微镜下观察到绿色圆形生物素化微泡周围可见红色点状的载基因生物素化阳离子脂质体。新型微泡的平均载基因率35%，普通微泡为10%。大鼠肝脏造影显示载基因阳离子脂质体-微泡能和普通微泡一样能明显增强肝脏显影。4.超声联合新型超声微泡介导CTGF的人工microRNA抑制大鼠肝纤维化HE染色、Masson染色和Sirius red染色显示CTGF人工microRNA能明显减轻DMN引起的大鼠肝纤维化程度。实时荧光定量PCR和Western Blot检测显示DMN模型组CTGFmRNA和蛋白水平较正常对照组明显升高，而CTGF人工microRNA处理后明显降低，以载基因新型微泡+超声组最为明显。免疫组织化学染色显示DMN模型组TGF-β1、α-SMA蛋白水平较正常对照组明显升高，CTGF人工microRNA处理后明显降低，以载基因新型微泡+超声组最为明显。结论1.成功构建了靶向CTGF基因的人工microRNA质粒表达载体，并筛选出对CTGF基因抑制作用最强的质粒。2.发现高机械指数诊断超声联合微泡能安全有效提高肝区微血管通透性及肝细胞通透性。3.生物素-亲和素系统可成功将载基因生物素化阳离子脂质体与生物素化微泡偶联起来制备出新型微泡载体，在提高微泡基因携带量的同时并不改变微泡的声学特性。4.新型超声微泡载体联合超声介导CTGF人工microRNA能明显抑制大鼠肝纤维化程度。