酶催化对于代谢过程等生命活动发挥着至关重要的作用。自然界的酶催化过程大多由多个反应步骤或级联反应来实现的。对多酶催化系统而言,应充分利用每种酶的催化活性,通过微环境工程来改善级联反应的不相容性,调节酶的催化活性,从而实现多酶协同高效催化。本文利用带电聚合物共价修饰对酶营造酸碱微环境,通过分子动力学模拟优化了修饰程度并解释了机理,并通过实验验证了酶催化活性的提高。本论文主要研究工作如下:(1)构建了双酶催化的微环境体系。通过H++计算了细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)和 D 型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)在2、4.5、7、8.5、10共5种pH值下的蛋白质状态,并通过高斯计算电荷分布,用于GROMACS模拟。通过溶剂可及性分析确定双酶蛋白的修饰位点,对Cyt C在5种pH值下进行了 3种不同程度地修饰5个重复单元的聚丙烯酸(polyacrylicacid,PAA),对DAAO在5种pH值下进行了 4种不同程度地修饰5个重复单元的聚烯丙胺(polyallylamine,PAM)。(2)分析了微环境调控对双酶体系的影响机制。通过读取双酶在不同pH值、不同修饰程度下共45个体系在100ns范围内的轨迹文件,分析净带电量、静电势能、溶剂可及表面积(solvent-accessible surface area,SASA)、蛋白质和水分子间氢键的数目呈梯度增加,表明修饰后增加了酶-聚合物复合物的电量和极性;分析均方根偏差(root-mean-squaredeviations,RMSD)、蛋白质分子内氢键和二级结构证明了带电聚合物在维持蛋白质的空间结构的前提下,可以缓冲极端pH值对酶的稳定性的破坏,起到微环境的保护作用。此外,还确定了双酶的最佳修饰度分别为[Cyt C-PAA]0.7和[DAAO-PAM]0.7,进行了活性位点和热稳定性的分析。(3)验证了聚合物微环境的调控对酶活的提高。通过EDC-NHS法对Cyt C和DAAO分别共价修饰分子量为5000Da的PAA和分子量为17000 Da的PAM后,在增大了酶蛋白的粒径、带电量的同时,保证了蛋白质结构的完整性。双酶修饰后,在不同pH值下,酶活均有不同程度地提高,在pH=7时,Cyt C修饰PAA后酶活提高为原来的2.2倍;pH=2和pH=4.5时,DAAO修饰PAM后酶活提高为原来的2.1倍,且双酶在最佳pH值下,修饰聚合物后酶活也有明显提高。