亚胺还原酶(Imine Reductase,IRED)是一类依赖于辅酶NADPH的氧化还原酶,能催化亚胺或酮和胺不对称合成相应的手性胺,且具有立体选择性高、反应条件温和的独特优势,对于手性胺类药物及其中间体的制备有重要意义。手性胺类药物临床应用广泛,目前工业上合成手性胺类药物中间体主要采用化学合成或外消旋体拆分等方法,反应条件较苛刻,步骤繁琐且对环境污染严重。本论文通过构建IRED和GDH共表达菌株,实现辅酶NADPH的循环再生,降低了亚胺还原酶催化反应的成本,实现绿色高效合成手性胺。同时,本论文结合蛋白结构分析和定点突变等生物学手段对亚胺还原酶结构进行改造,探索了获得酶活等性质优化的突变体的可能性。在本论文中,来自蜡状芽孢杆菌的亚胺还原酶和来自芽孢杆菌属的葡萄糖脱氢酶分别被克隆到质粒p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET28a-ired和p ET28a-gdh。以重组质粒为模板构建共表达质粒p ET28a-ired-gdh,转化后获得共表达菌株BL21(DE3)/p ET28a-ired-gdh,诱导蛋白表达后测定酶活分别为68 U/g和58 U/g。以2MPN为底物,以共表达菌株为全细胞催化剂,优化了反应温度、p H、有机溶剂甲醇浓度等影响因素,最终在37℃、p H为8时,添加10%甲醇反应最终转化率和光学纯度均大于95%。底物特异性研究发现该酶无法催化合成索非那新和利伐斯的明中间体,推测该酶底物结合域较窄或亲和性较差。利用Hot Spot Wizard 2.0分析蛋白结构,预测蛋白的可突变氨基酸位点及可能的有益突变方向,通过全质粒PCR构建突变体。酶活检测和生物催化实验结果显示,突变体M192L相对野生型酶活升高,但转化率降低,说明该突变体的稳定性有所降低;突变体W196L相对野生型酶活和转化率均降低,说明该位点的确为酶活关键位点;突变体G256A和S259G相对野生型酶活均降低,但转化率与原蛋白相比保持基本一致或有所提高,推测该位点突变后蛋白的稳定性增强。突变蛋白酶活和转化率的改变是由于突变氨基酸位点的疏水性和周围环境之间作用力的改变所致。目前对于亚胺还原酶辅酶再生系统和定点突变相关的研究较为欠缺,亚胺还原酶的具体催化机制仍需探究。本研究构建了亚胺还原酶辅酶再生体系并优化反应条件,利用定点突变技术尝试进行酶学性质优化,获得了关键酶活位点,为规模性生物催化制备手性胺和进一步优化酶的性质打下了基础。