胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)属鲤形目(Cypriniformes)胭脂鱼科(Catostomidae),仅分布于我国长江和闽江,是我国特有的淡水珍稀物种。胭脂鱼体型奇特、色彩绚丽、味道鲜美,具有很高的观赏和食用价值。胭脂鱼是我国长江流域的重要经济鱼类,但是由于近些年人类活动的频繁导致其数量骤降,其生境一度面临着严峻的挑战,通过科学的人工繁殖放流已使得其数量得到稳步的回升。人工繁殖成为保护胭脂鱼这一种群的重要途径。但是随着人工养殖规模的扩大,其面临的病害也随之增加,造成较高的死亡率,这是目前胭脂鱼人工养殖中面临的一大困境。我们试图从胭脂鱼的免疫系统中的细胞因子入手,希望为解决胭脂鱼人工繁殖中存在的困境提供理论依据和解决措施。细胞因子是一群相对分子量较小的蛋白,活性极高,产生的时间短暂,通常通过自分泌或旁分泌的形式发挥作用。细胞因子作为免疫系统中一类重要的传导信号的分子,是免疫细胞间信号网络的组成部分,在炎症反应、防御病毒感染、特异性T、B细胞克隆的增殖及其功能等方面起作用。肿瘤坏死因子配体超家族在调节免疫反应中起到了关键作用,这些配体中的大多数是典型的Ⅱ型跨膜蛋白,可以在蛋白酶切割后作为可溶性的细胞因子发挥作用。BAFF是肿瘤坏死因子超家族的成员之一,与受体结合后,能够通过信号传导作用刺激B淋巴细胞分化增殖并诱导其分泌免疫球蛋白。BAFF含有保守的胞内N-末端跨膜结构域和胞外C-末端TNF同源结构域。与其他TNF超家族成员相比,在其可溶性晶体结构中存在较长的D-E环(flap),并且该”flap”在形成三聚体或衣壳样多聚体后与受体结合的过程中起十分重要的作用。目前确定BAFF受体家族成员有三个:BAFF受体、B细胞成熟抗原受体和跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子。BAFF主要表达于先天免疫细胞,如单核细胞,树突状细胞,巨噬细胞,活化的T细胞,嗜中性粒细胞和一些非造血细胞。本文首先根据几种已知硬骨鱼类BAFF的氨基酸序列设计兼并引物,同源克隆和RACE技术获得了胭脂鱼BAFF的全长序列。胭脂鱼BAFF cDNA全长1382bp,其中5’非编码区和3’非编码区各110bp和563bp,开放阅读框长819bp,共编码272个氨基酸,预测的蛋白质的分子量为30.384kD,等电点为5.82。氨基酸多重序列比对结果显示,胭脂鱼BAFF分子由胞内区、跨膜区和胞外区组成,其中胞外区存在TNF家族域,TNF家族域具有9个氨基酸长的D-E loop(“flap”)。通过对胭脂鱼BAFF单体分子的进行同源建模显示其三维结构与其他物种BAFF分子的三维结构高度一致。系统进化树则表明,胭脂鱼的BAFF分子与斑马鱼、草鱼、鲫鱼和南亚野鲮的BAFF分子聚为一支。采用相对定量和绝对定量两种方法对胭脂鱼BAFF组织表达模式进行研究。绝对定量是通过测定胭脂鱼BAFF在各组织的拷贝数,其结果为在脾中的拷贝数最多,其他组织中拷贝数相差甚小。相对定量首先通过测定GAPDH、β-actin、18s rRNA和L18a在各组织中的拷贝数和用geNorm软件进行内参基因稳定性评估,得出这四个基因作为内参的稳定性顺序为L18a=18s rRNA>β-actin>GAPDH。分别以L18a和18s rRNA作为内参对胭脂鱼BAFF在各组织进行定量,其结果显示在各组织中都有分布,并且表达量差异不大,在脾中的相对表达量均排第二位。从绝对定量和相对定量的两种结果得出结论:胭脂鱼BAFF在各组织中广泛分布,在脾中的表达量高。我们选取L18a作为内参基因对胭脂鱼BAFF基因早期发育阶段进行半定量分析,结果显示BAFF在胭脂鱼的受精卵就可检测到,并且随着时间的增加,其表达在孵化21天后趋于稳定。灭活的嗜水气单胞菌刺激胭脂鱼BAFF和IgM的相对表达量结果显示:BAFF的表达量在刺激48h时,在脾中表达量开始升高;在头肾中BAFF和IgM的表达量都在48h时达到峰值。在外周血白细胞和腹腔细胞中BAFF和IgM的表达量变化不明显。利用大肠杆菌原核表达成功表达了BAFF重组蛋白,并对其进行了SDS-PAGE和western blot检测,目的蛋白主要以包涵体形式表达,分子量约为20 KDa。间接免疫荧光显示该蛋白能够与胭脂鱼外周血白细胞结合;体外CCK-8检测该蛋白在浓度为200ng/ml时对胭脂鱼外周血白细胞有一定的促存活作用。在本研究中,我们克隆得到了胭脂鱼BAFF的cDNA全长,对推测氨基酸序列进行了生物学分析,并且利用SWISS-MODEL构建了蛋白质的三维结构。对BAFF在胭脂鱼组织中的表达模式以及嗜水气单胞菌刺激后的BAFF和IgM表达变化进行检测。重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,对其进行了生物学功能的鉴定。我们期望研究结果能够为胭脂鱼免疫系统的研究提供一定的理论依据,有望MasBAFF成为免疫增强剂来提高胭脂鱼的免疫力以及为胭脂鱼疾病诊断和治疗提供解决方案。