论文部分内容阅读
非生物胁迫如盐、盐碱、干旱和低温等是限制植物生长发育的主要因素。Ca2+信号途径在植物抗逆机制中具有重要的作用，它可以被环境刺激所激活，瞬时增加胞内Ca2+的浓度，进而激活钙调蛋白（CaM），被激活的CaM与CAMTA转录因子结合进而启动植物的防御系统。在本研究中，将MsCAMTA2基因通过农杆菌介导法转化到烟草中，分析该基因在非生物胁迫下的功能。主要研究结果如下：
1.MsCAMTA2基因的组织特异性表达以及非生物胁迫下的表达模式分析
qRT-PCR分析结果表明，MsCAMTA2基因在紫花苜蓿的根、茎、叶、花和荚果中均有表达，并且表达量最高的是根组织。选取4周龄的紫花苜蓿分别在盐（200mmol/L NaCl）、混合盐碱（100mmol/L NaHCO3:Na2CO3=2:1）、ABA（30μmol/L）以及甘露醇（150mmol/L）模拟的干旱胁迫下进行qRT-PCR检测，发现MsCAMTA2基因可以被这4种非生物胁迫诱导表达，尤其是在干旱胁迫下，在1h时表达量迅速上升，说明该基因在干旱胁迫下可以被快速诱导。
2.MsCAMTA2基因对烟草的遗传转化
通过农杆菌介导法将MsCAMTA2基因导入到烟草中，用草丁膦（PPT）进行筛选共获得32株抗性植株，经过PCR鉴定获得20株转MsCAMTA2基因烟草。选取长势及生长状态一致的转MsCAMTA2基因烟草进行qRT-PCR检测，结果表明在转MsCAMTA2基因烟草中该基因都得到表达，其中在OE7、OE28和OE36中MsCAMTA2基因的表达量最高，用于后续的实验研究。
3.转MsCAMTA2基因烟草的抗逆性分析
（1）转MsCAMTA2基因烟草在盐、盐碱和干旱胁迫下的相关表型分析
在300mmol/L NaCl、30mmol/L NaHCO3和150mmol/L甘露醇模拟干旱的胁迫下，通过对转MsCAMTA2基因烟草进行表型观察来评价转MsCAMTA2基因烟草对胁迫的抗性。结果显示：转MsCAMTA2基因烟草打孔叶圆片的失绿程度和整株烟草叶片的萎蔫程度均低于野生型，尤其是干旱1个月后的复水实验表明，转MsCAMTA2基因烟草的返绿程度和恢复能力都强于野生型烟草，表现出明显的胁迫抗性。
（2）转MsCAMTA2基因烟草在盐、盐碱和干旱胁迫下的相关生理指标分析
通过对转MsCAMTA2基因烟草进行相关生理指标测定来评价转MsCAMTA2基因烟草对胁迫的抗性。结果显示：在盐、盐碱和干旱胁迫下，转MsCAMTA2基因烟草的叶绿素含量、渗透调节物质（可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸）和抗氧化物酶的活性（POD、SOD、CAT）均显著高于野生型烟草。但MDA、O2-、H2O2的含量均显著低于野生型。并且胁迫下的染色实验表明，转MsCAMTA2基因烟草的着色程度低于野生型烟草，侧面也说明了转基因烟草积累的活性氧物质低于野生型烟草。另一方面，烟草的ABA平板根长实验结果显示：转MsCAMTA2基因烟草的根长度比野生型烟草短，表明MsCAMTA2基因的表达可能影响植物对ABA的响应，暗示着MsCAMTA2基因调控的植物抗逆机制可能与ABA途径存在交叉。以上研究表明，在烟草中过表达MsCAMTA2基因可以提高植株对盐、盐碱和干旱胁迫的抗性。
1.MsCAMTA2基因的组织特异性表达以及非生物胁迫下的表达模式分析
qRT-PCR分析结果表明，MsCAMTA2基因在紫花苜蓿的根、茎、叶、花和荚果中均有表达，并且表达量最高的是根组织。选取4周龄的紫花苜蓿分别在盐（200mmol/L NaCl）、混合盐碱（100mmol/L NaHCO3:Na2CO3=2:1）、ABA（30μmol/L）以及甘露醇（150mmol/L）模拟的干旱胁迫下进行qRT-PCR检测，发现MsCAMTA2基因可以被这4种非生物胁迫诱导表达，尤其是在干旱胁迫下，在1h时表达量迅速上升，说明该基因在干旱胁迫下可以被快速诱导。
2.MsCAMTA2基因对烟草的遗传转化
通过农杆菌介导法将MsCAMTA2基因导入到烟草中，用草丁膦（PPT）进行筛选共获得32株抗性植株，经过PCR鉴定获得20株转MsCAMTA2基因烟草。选取长势及生长状态一致的转MsCAMTA2基因烟草进行qRT-PCR检测，结果表明在转MsCAMTA2基因烟草中该基因都得到表达，其中在OE7、OE28和OE36中MsCAMTA2基因的表达量最高，用于后续的实验研究。
3.转MsCAMTA2基因烟草的抗逆性分析
（1）转MsCAMTA2基因烟草在盐、盐碱和干旱胁迫下的相关表型分析
在300mmol/L NaCl、30mmol/L NaHCO3和150mmol/L甘露醇模拟干旱的胁迫下，通过对转MsCAMTA2基因烟草进行表型观察来评价转MsCAMTA2基因烟草对胁迫的抗性。结果显示：转MsCAMTA2基因烟草打孔叶圆片的失绿程度和整株烟草叶片的萎蔫程度均低于野生型，尤其是干旱1个月后的复水实验表明，转MsCAMTA2基因烟草的返绿程度和恢复能力都强于野生型烟草，表现出明显的胁迫抗性。
（2）转MsCAMTA2基因烟草在盐、盐碱和干旱胁迫下的相关生理指标分析
通过对转MsCAMTA2基因烟草进行相关生理指标测定来评价转MsCAMTA2基因烟草对胁迫的抗性。结果显示：在盐、盐碱和干旱胁迫下，转MsCAMTA2基因烟草的叶绿素含量、渗透调节物质（可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸）和抗氧化物酶的活性（POD、SOD、CAT）均显著高于野生型烟草。但MDA、O2-、H2O2的含量均显著低于野生型。并且胁迫下的染色实验表明，转MsCAMTA2基因烟草的着色程度低于野生型烟草，侧面也说明了转基因烟草积累的活性氧物质低于野生型烟草。另一方面，烟草的ABA平板根长实验结果显示：转MsCAMTA2基因烟草的根长度比野生型烟草短，表明MsCAMTA2基因的表达可能影响植物对ABA的响应，暗示着MsCAMTA2基因调控的植物抗逆机制可能与ABA途径存在交叉。以上研究表明，在烟草中过表达MsCAMTA2基因可以提高植株对盐、盐碱和干旱胁迫的抗性。