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一、实验目的本文旨在研究甘草酸(GL)、甘草次酸(GA)对外排蛋白P-glycoprotein (P-gp)的功能及其表达的影响,并比较甘草酸、甘草次酸的区别,为其应用提供依据。二、实验方法1.细胞毒性实验采用MTT法进行细胞毒性实验,使实验过程中采用的细胞活性>90%。2. Rhodamine123(Rh123)积累实验用流式细胞仪测定P-gp底物Rhl23在Caco-2细胞中积累的变化,以确定甘草酸、甘草次酸对P-gp的功能的影响。3.P-gp与MDR1mRNA的表达测定采用Western blot与RT-qPCR两种方法分别测定GL、GA酸对Caco-2细胞中P-gp与MDR1mRNA表达,从分子水平上探究GL、GA影响P-gp表达的机制。三、实验结果1.细胞毒性实验确定实验条件下各药物的实验浓度范围(与Caco-2细胞孵育48h后,细胞活性>90%)：甘草酸(25-400μM)、甘草次酸(25-200μM)。2.Rh123积累实验GL与Caco-2细胞共孵育24h,细胞中Rh123的积累量无明显变化；共孵育48h,细胞中Rh123的积累量增加,与GL浓度呈正相关。GA与Caco-2细胞共孵育24h/48h均能显著增加Rh123的积累量。细胞中Rh123的积累量与GA浓度呈正相关。3.P-gp的表达测定GL与Caco-2细胞共孵育24h,细胞中P-gp的表达量无明显变化；共孵育48h,细胞中P-gp的表达减少,与GL浓度呈负相关。GA与Caco-2细胞共孵育24h/48h均能显著减少P-gp的表达量。细胞中P-gp的表达量与GA浓度呈负相关。4. MDR1mRNA的表达测定GL与Caco-2细胞共孵育24h,低浓度的GL促进mRNA的表达量,高浓度的GL抑制mRNA的表达；共孵育48h,细胞中mRNA的表达减少,与GL浓度呈负相关。GA与Caco-2细胞共孵育24h/48h均能显著减少mRNA的表达量。细胞中mRNA的表达量与GA浓度呈负相关。四、结论1.48小时作用下,甘草酸、甘草次酸可能是通过抑制MDR1mRNA的表达水平而下调P-gp的水平,从而达到影响P-gp转运功能。2.24小时作用下,甘草次酸的作用效果与长时间作用(48h)相同；甘草酸对P-gp的表达与功能无明显作用,对MDR1mRNA的表达呈现两极作用。3.甘草酸、甘草次酸可能成为多药耐药抑制剂,辅助肿瘤化疗。相同剂量时,甘草次酸的抑制效果强于甘草酸。