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目的光遗传学是一项将光控技术与遗传学技术相结合的新技术,即将光敏感的离子通道蛋白表达于可兴奋的靶细胞或靶器官上,利用特定波长的光照激活光敏感离子通道以实现对细胞、组织、器官及动物生理功能的精细调控。而光敏感蛋白基因的转染与表达、光照的调控是实现光遗传学的两个关键步骤,本实验旨在探索适合视紫红质通道蛋白2基因转染与表达的可靠方法,并探索成功实现心脏光起搏的光照参数,为光遗传学步入临床提供相应的实验支持。方法1.小鼠离体灌流心脏免疫荧光检测及光起搏模型的建立将6只健康成年雌性C57小鼠(18-20g)经颈静脉注射给予AAV9-CAG-hChR2-mcherry2.5 ×110^12gc,并于武汉大学人民医院动物房spf环境中饲养。8周后,取2只小鼠心脏,进行免疫荧光检测,检测hChR2转染率,其余4只小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉,肝素抗凝10min,建立小鼠离体灌流模型。参考文献,给予光照频率400次/分,光照强度1.5mw/mm2,光照持续时间20ms,观察小鼠离体灌流心脏的起搏情况。给予473nm蓝光照射,分别在左心室、右心室、左心房给予光照刺激,S1S1光照刺激频率分别为350次/分,400次/分;在一定光照频率(350次/分-400次/分)、光照强度(0.2mw/mm2-2mw/mm2),光照持续时间(1ms-50ms)及其不同组合下,测定引起小鼠离体灌流心脏光起搏的光照持续时间阈值,光照强度阈值;S1S2刺激法测有效不应期,在8个S1S1刺激的基础上加发S2期前刺激,S1S2偶联间期以步长5ms负扫描,测量小鼠离体灌流心脏的有效不应期。2.大鼠在体心脏光起搏模型的建立及心脏功能、组织学改变将18只健康成年雄性SD大鼠(220-230g)随机分为三组,空白对照组6只,空载对照组6只,实验组6只,经颈静脉注射分别给予空白对照组等量PBS,空载对照组 AAV9-CAG-mcherry1.0 × 10^13gc,实验组 AAV9-CAG-hChR2-mcherry1.0 ×10^13gc。8周后做超声心动图检测心功能,并行大鼠心脏光起搏模型的建立,给予473nm蓝光照射大鼠心脏不同部位,包括左心室、右心室、左心房;S1S1刺激频率自400次/分至600次/分;在光照频率(400次/分-600次/分)、光照强度(0.2mw/mm2-2mw/mm2),光照持续时间(1ms-50ms)及其不同组合下,测定引起小鼠离体灌流心脏光起搏的光照持续时间阈值,光照强度阈值;S1S2刺激法测有效不应期,在8个S1S1刺激的基础上加发S2期前刺激,S1S2偶联间期以步长5ms负扫描,测量大鼠心脏有效不应期。处死动物,留取心房、左室、右室、室间隔等部位心肌组织,倒置荧光显微镜观察hChR2表达情况,HE染色观察组织形态,TUNEL检测心肌细胞凋亡。结果1.小鼠离体灌流心脏光起搏模型建立成功。成功实现不同频率蓝光照射对小鼠离体灌流心脏的夺获,左心室、右心室、左心房均可实现光起搏,并测得光照持续时间阈值为2ms,光照强度阈值为0.42mw/mm2,小鼠离体灌流心脏有效不应期为55ms。2.超声心动图显示大鼠心功能正常,左室射血分数均在88%以上;蓝光照射起搏大鼠在体心脏失败,未能建立大鼠在体心脏光起搏模型。经免疫荧光检测大鼠心脏显示hChR2在心肌细胞的转染率较低;HE染色显示心肌结构清晰,无炎症细胞及脂肪滴浸润;TUNEL结果显示心肌细胞无凋亡。结论经颈静脉注射AAV9是实现光敏感蛋白转染与表达的一种简便、安全、有效的方式,并探索出起搏小鼠离体灌流心脏所需的光照参数,为后期光遗传学的实施提供相应的实验基础;大鼠光起搏模型建立失败,较低的hChR2转染率可能是其失败的主要原因,但是其心脏功能、组织形态皆正常,无明显细胞凋亡。