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目的:探讨高保真度DNA聚合酶藕联硫代磷酸化修饰的特异性检测引物构成的突变敏感性分子开关检测基因突变的技术平台在筛查临床宫颈癌患者组织DNA中EGFR基因G719S、T790M两位点突变的应用,并分析两位点突变与宫颈癌的相关性,从而指导临床EGFR-TKI类药物的合理使用。方法:采用高保真DNA聚合酶介导的突变敏感性分子开关技术检测EGFR基因18外显子G719S位点和20外显子T790M位点突变进行检测。首先,分别提取健康志愿者全血基因组DNA和组织DNA。先以健康全血基因组DNA作为模板,通过重叠延伸PCR技术,得到两位点的融合片段。再将融合产物克隆到PMD19-T载体,得到包含两位点的野生模板,进行测序鉴定。并以野生型质粒为模板,利用Muta Primer2.0软件设计定点突变引物,实施体外定点突变,得到两位点的突变目的产物,并将延伸反应产物克隆到T载体,氨苄青霉素与蓝白筛选得到突变模板质粒,并通过测序分析确认。以这两位点为靶点,设计G719S和T790M两位点的野生型特异性检测与突变型特异性检测引物,并硫化修饰引物3’末端,利用高保真度DNA聚合酶介导的PCR进行引物延伸反应。再通过成功构建好的平台下对宫颈癌组织DNA样本中EGFR基因G719S和T790M位点突变进行检测,统计分析EGFR基因两位点突变与宫颈癌的相关性,并指导EGFR-TKI靶向合理用药。结果:利用体外定点诱变技术成功构建EGFR基因两位点野生型质粒和突变型质粒。在同一反应体系中对两位点突变进行检测,结果显示,使用突变型质粒模板,突变敏感性分子开关能够与突变型等位基因特异性检测引物延伸,而不配对的野生型等位基因特异性检测引物不能被延伸,没有非特异性条带。突变敏感性分子开关对80例临床宫颈癌组织DNA样本进行检测,均没有检测出两位点突变,与DNA测序结果一致。G719S、T790M两位点的基因型分别为GG、CC纯合子,与对照组相比均没有统计学差异(P>0.05)。结论:建立了检测EGFR基因两位点突变的分子开关技术平台,并成功将此技术运用到临床宫颈癌组织DNA样本G719S、T790M两位点的筛查,统计分析发现G719S、T790M两位点与宫颈癌可能没有明显关联,从而为指导临床医师合理使用靶向EGFR-TKI提供依据。