急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是各种致病因素导致的肺组织液体生成增多或重吸收障碍以及肺组织大量炎症细胞浸润和炎症介质释放,使气血交换不足,氧合下降,最终出现的呼吸衰竭综合征。ALI/ARDS致病因素复杂,包括各种肺内外致病因素,如重症肺炎、胃内容物误吸、败血症、重度烧伤和创伤等。在美国,每年约有200,000重症ARDS患者,其死亡率为40%。ARDS发病率逐年升高,病情凶险,严重威胁患者生命健康状况。近30年来,尽管大量基础研究和临床试验显示某些药物或干细胞治疗可改善ALI/ARDS患者或动物模型肺损伤指标,但是,目前临床上除机械通气等对症支持治疗和加强护理外,美国食品与药品监督局(Food and Drug Administration,FDA)暂未批准治疗ARDS的有效药物。因此,探索与ALI/ARDS发生发展相关的分子靶点,发现可能预防和治疗ALI/ARDS的药物具有重要意义。Rho激酶(Rho Kinase,ROCK)是一种小分子GTP结合蛋白Rho的效应器。研究表明,Rho/ROCK信号在各种细胞功能中发挥重要作用,例如平滑肌细胞收缩、肌动蛋白细胞骨架重构、细胞粘附、细胞运动、炎症细胞迁移、细胞分裂和基因表达等。ROCK信号参与多种疾病的发生,例如中风、血管痉挛、动脉硬化、高血压、心力衰竭和缺血再灌注损伤等。研究表明,在呼吸系统疾病中,ROCK抑制剂能有效缓解肺动脉高压、支气管哮喘、肺纤维化等疾病;此外,动物实验研究显示抑制ROCK活性可减轻气道炎症,改善肺损伤,但ROCK抑制剂预防肺损伤的机制尚不明确。由于肺微血管内皮细胞是呼吸膜的组成成分之一,在肺损伤所致的肺水肿和肺部炎症中发挥重要作用,而ROCK在肺血管内皮细胞表达含量较高,且与炎症反应密切相关。因此,本文第一部分工作通过构建小鼠ALI模型,观察ROCK抑制剂法舒地尔对LPS诱导的肺组织病理损伤、肺部炎症、肺组织通透性以及肺内皮细胞凋亡是否有保护作用;第二部分工作通过建立中性粒细胞-内皮细胞共培养体系,运用LPS体外诱导人肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)炎症反应、内皮屏障损伤和细胞凋亡,深入探讨法舒地尔对ALI发挥保护作用的细胞和分子生物学机制。第一部分法舒地尔对小鼠急性肺损伤的保护作用目的:观察法舒地尔对ALI小鼠肺组织ROCK活性、病理损伤、中性粒细胞渗出、炎症介质释放、肺组织通透性、肺水转运以及肺内皮细胞凋亡的影响。方法:运用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,5mg/kg)气道滴注构建小鼠急性肺损伤模型,fasudil组和LPS + fasudil组小鼠在造模前1小时予以腹腔注射法舒地尔(10mg/kg)。造模24小时后,处死小鼠,分别收集动物外周血、肺组织、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)标本。运用苏木素-伊红(hematoxylin-and-eosin,HE)染色观察各组小鼠肺组织病理损伤变化;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠肺组织和外周血细胞因子IL-6、TNF-α水平;免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)观察肺组织中性粒细胞浸润情况;酶标仪法测定BALF中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性和肺组织中伊文斯蓝(evans blue dye,EB)渗出含量;BCA法测定BALF中蛋白浓度;蛋白质免疫印迹法(western blotting)检测肺组织ROCK活性和水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)的表达水平;免疫荧光染色双标法观察肺组织内皮细胞凋亡情况。结果:首先,气道滴注LPS导致的肺组织ROCK活性升高能被法舒地尔抑制;法舒地尔显著减轻LPS诱导的肺组织病理损伤、抑制中性粒细胞浸润、逆转BALF中MPO活性和中性粒细胞水平;LPS导致肺组织和外周血细胞因子IL-6和TNF-α水平升高,该作用能被法舒地尔抑制;其次,法舒地尔显著抑制LPS诱导的肺泡灌洗液蛋白和EB渗出,减轻LPS诱导的肺血管内皮细胞凋亡.,最后,法舒地尔可逆转LPS诱导的AQP5下调。结论:整体实验研究结果显示,ROCK抑制剂法舒地尔能显著改善LPS诱导的小鼠ALI,主要表现为法舒地尔能减轻LPS诱导的肺组织病理损伤、抑制中性粒细胞浸润和炎症介质释放,降低肺组织通透性,减少肺血管内皮细胞凋亡和促进肺泡腔液体转运。第二部分法舒地尔对急性肺损伤保护作用的机制研究目的:运用LPS体外诱导HPMECs炎症反应、内皮屏障损伤和细胞凋亡,探讨法舒地尔对ALI发挥保护作用的细胞和分子生物学机制。方法:将HPMECs(4-6代)予以不同处理:Con组,1%ECM孵育;fasudil组,1%ECM+1μg/mlfasudil 孵育;LPS 组,1%ECM+1 μg/ml LPS 孵育;LPS+fasudil 组,1%ECM++1μg/mlLPS+1μg/ml(或 0.04μg/ml,0.2μg/ml,1μg/ml)fasudil孵育,法舒地尔在LPS刺激HPMECs前半小时加入;运用慢病毒转染的方法使 HPMECs 中骨形态蛋白受 Ⅱ(Bone Morphogenic Protein Receptor Ⅱ,BMPRII)表达上调或下调,予以法舒地尔和LPS处理。根据不同实验方法及目的,于特定时间点收集细胞和细胞上清进行相关检测。运用内皮细胞-中性粒细胞共培养的方法检测HPMECs对中性粒细胞的趋化和粘附作用;实时定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)检测趋化因子 CXCL1,CXCL2 和 CXCL8的表达;ELISA测定细胞上清中CXCL8的含量。运用western blotting检测细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule[ICAM]-1)、BMPRⅡ 的表达,ROCK、NF-κB和MAPK信号活化情况,细胞间连接蛋白包括血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、闭锁小带蛋白-1(zonula occludens[ZO]-1)和凋亡相关蛋白表达水平。荧光酶标仪检测PMECs对低分子右旋糖酐的通透性;免疫荧光染色观察NF-κB p65核转位情况以及VE-cadherin、ZO-1在PMECs中的表达分布;Hoechest 33342染色观察细胞凋亡。结果:首先,法舒地尔浓度依赖性地下调LPS诱导的趋化因子CXCL1,CXCL2和CXCL8的转录以及CXCL8的分泌,抑制中性粒细胞向活化的内皮细胞趋化。其次,法舒地尔通过上调PMECs中BMPRII水平,抑制ICAM-1的表达,减少中性粒细胞与活化的HPMECs粘附。LPS导致的HPMECs中ROCK、NF-κBP65和p38MAPK活化能被法舒地尔阻断。最后,法舒地尔显著上调LPS诱导的VE-cadherin,ZO-1表达下降,降低HPMECs的通透性;此外,法舒地尔抑制LPS诱导的凋亡蛋白pro-caspase3的剪切和HPMECs凋亡。结论:法舒地尔通过抑制肺微血管内皮细胞功能紊乱,减轻LPS诱导的小鼠ALI。法舒地尔抑制肺微管内皮细胞功能障碍具体表现为以下三个方面:第一,法舒地尔下调LPS诱导的内皮细胞释放趋化因子,抑制中性粒细胞向HPMECs趋化;第二,法舒地尔下调LPS诱导的内皮细胞粘附分子的表达,抑制中性粒细胞向PMECs粘附。第三,法舒地尔通过上调HPMECs粘附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白ZO-1的表达,降低PMECs通透性;此外,法舒地尔抑制LPS诱导的PMECs凋亡。