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目前,非小细胞肺癌(NSCLC)疗效不佳,其中重要的原因是肿瘤组织抗凋亡相关基因表达上调,癌细胞凋亡减少,癌细胞整体耐药增加。通过反义核酸技术抑制肿瘤抗凋亡基因表达,选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡,对于迅速有效地清除肿瘤细胞具有重要意义,是肿瘤基因治疗的一项重要策略。然而,诱导凋亡的靶向性差和特异性差是目前限制其疗效的两个重要因素。选择肿瘤细胞特异表达基因并特异性地抑制其表达,是靶向诱导肿瘤细胞凋亡的关键。RNA干涉(RNAi)技术阻断基因表达具有高稳定、高效率和高特异的特点,可望作为反义核酸的优化方式成为肿瘤基因治疗的新手段。人类凋亡抑制蛋白家族新成员,Livin,存在相差仅54bp却具有不同抗凋亡功能的两种异构体(isoform)Livinα和Livinβ,在胚胎组织和肿瘤组织中限制性表达。因此,分析Livin与肺癌发生、发展、治疗、预后的关系,并建立Livin异构体特异的RNAi表达体系对研究Livin异构体生物功能和靶向诱导癌细胞凋亡具有重要意义。研究目的1、研究Livin两种异构体在NSCLC中表达情况,分析Livin表达与肿瘤分型、和肿瘤治疗的关系。2、建立Livin基因异构体表达体系,探讨其在肿瘤放化治疗中不同的抗凋亡功能。3、建立Livin异构体特异的小干涉RNA(siRNA)表达体系,探讨其在诱导肺癌细胞凋亡中的价值及其临床意义。研究内容和方法1、Livin基因异构体在NSCLC中的表达及其意义收集临床NSCLC的手术切除标本及完整临床病历资料,采用RT-PCR和western blot方法检测肺癌组织及两种肺腺癌细胞株A549和SPC-A1中Livin基因的表达,分析其表达与肿瘤病理分型、术前放化疗之间的关系。2、Livin基因异构体在A549细胞中的表达及其功能研究提取SPC-A1细胞总RNA,RT-PCR扩增Livin基因异构体全长cDNA序列,构国家自然科学基金资助项目,编号:30200282<WP=12>建Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livinα和pcDNA3.1-Livinβ)。电穿孔法基因转染A549细胞,G418抗性筛选后获得阳性克隆。MTT法(四唑盐比色法)检测Livin基因异构体在化疗药物及放射线作用下不同抗凋亡功能;10Gy钴60(60Co)照射转染后A549细胞,流式细胞仪检测Livin基因异构体对A549在放射线作用下细胞周期的影响;2Gy60Co照射未转染的A549细胞,RT-PCR检测放射线对Livin基因诱导表达。3、Livin异构体基因沉默诱导NSCLC细胞凋亡研究分别针对Livinα和Livinβ cDNA差异区域及共有BIR结构域mRNA序列,筛选、设计、合成siRNA相关基因片段,高Livin异构体特异的siRNA表达载体pAVU6+27-Livin及pSilencer-Livin,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。电穿孔法基因转染SPC-A1细胞,G418抗性筛选获得阳性克隆。半定量RT-PCR和western blot法验证siRNA阻断Livin基因异构体表达的特异性和沉默效率;倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学改变;MTT法检测不同化疗药物及放射线对肺癌细胞存活率的影响;TUNEL(TdT介导的dUTP缺口末端标记)法检测肺癌细胞凋亡指数;流式细胞仪测定细胞凋亡率;建立荷瘤裸小鼠模型,并腹腔内给予化疗药物顺氯氨铂(CDDP),体内实验检测Livin异构体基因沉默在增敏CDDP诱导肺癌细胞凋亡治疗中的价值。研究结果1、Livin基因异构体在NSCLC中的表达及其意义48例NSCLC组织中Livin表达阳性率为22.9%,其表达与NSCLC组织学类型相关,即腺癌Livin表达阳性率达45.5%,明显高于鳞癌和大细胞癌,而癌旁组织和非肿瘤性疾病肺组织未检出阳性结果;Livin表达还与肿瘤治疗相关,放化治疗可明显诱导Livin表达(P<0.01)。两种肺腺癌细胞株A549和SPC-A1,前者不表达Livin基因,而后者高表达Livin基因两种异构体。2、Livin基因异构体在A549细胞中的表达及其功能研究通过双酶切鉴定和测序验证,成功克隆了Livin基因两种异构体的表达载体;基因转染A549细胞,经G418筛选获得阳性克隆细胞,RT-PCR和免疫荧光化学验证Livin基因异构体在A549细胞获得表达。表达两种异构体的肿瘤细胞对不同化疗药物及放射线产生的耐受效应总体上相似,但在程度上明显不同:Livinα在抗化疗药物方面强于Livinβ,但Livinβ抵抗足叶乙甙(VP16)和鬼臼噻吩甙(VM26)诱导的细胞凋亡中较前者明显增强。流式细胞仪细胞周期检测表明Livinα较Livinβ具有更显著的抗放射线诱导细胞凋亡作用。RT-PCR分析表明放射线能诱导Livin两种异构体在A549细胞中表达。 <WP=13>3、Livin异构体基因沉默诱导NSCLC细胞凋亡研究通过双酶切鉴定和测序验证,成功克隆了Livin基因两种异构体的siRNA表达载体,并通过基因转染实现了siRNA在SPC-A1肺腺癌细胞内的持续表达。半定量RT-PCR和western blot结果表明,siRNA阻断Livin基因表达效率为60-80%,阻断效率与靶点选择有关。基因转染后细胞形态在倒置显微镜下差异不大,在透射电镜下见到典型的凋亡细胞;Livin基因沉默后SPC-A1细胞克隆形成能力下降;TUNEL法观察到明显的凋亡细胞,基因沉默Livinα+β、Livinα、Livinβ诱导癌细胞自发凋亡指数分别为9.20%、6.75%和4.82%;流式细胞仪检测细胞凋亡率明显高于对照组,凋亡效应关系与TUNEL法结果相似;MTT法显示转染后细胞对化疗药物和放射线敏感性增加,与前一部分实验结果相似;成功建立裸小鼠移植瘤模型,腹腔内给予CDDP?