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本文针对从广西特色资源番木瓜中提取的木瓜酶,采用紫外、荧光、拉曼、圆二色等光谱技术研究了阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、阴离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、非离子型表面活性剂聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween-80)等三种不同类型表面活性剂对木瓜酶酶活力、水解动力学和构象的影响,主要研究结果如下。
1、表面活性剂对木瓜酶酶活力的影响:(1)CTAB对木瓜酶酶活力的影响,在所考察的三种pH值和CTAB浓度范围内,CTAB对木瓜酶酶活力均有明显增强作用,在一特定CTAB浓度,木瓜酶酶活力出现最大值,这种增强作用与CTAB浓度和pH有关。随着pH值增大,酶活力最大值处对应的CTAB浓度减小(pH=6.30、8.00、9.50木瓜酶酶活力最大时对应的CTAB浓度分别为1.5、1.0、0.5mmol·L-1),pH对CTAB增强木瓜酶酶活的影响顺序为:pH8.00>pH6.30>pH9.50。(2)SDS对木瓜酶酶活力的影响与pH有关,pH9.50时,SDS对木瓜酶酶活力产生抑制作用;pH8.00时,SDS对木瓜酶酶活力有增强作用;pH6.30时,除了在其CMC时木瓜酶酶活力得到增强外,其它浓度下SDS对木瓜酶酶活力没有影响。(3)Tween-80对木瓜酶酶活力的影响,Tween-80总体上对木瓜酶酶活力有抑制作用,而且随着浓度的增大,Tween-80对酶活力抑制作用增强,pH的影响大小顺序为:pH9.50>pH8.00>pH6.30。
2、表面活性剂对木瓜酶水解酪蛋白反应的影响:CTAB对木瓜酶水解酪蛋白反应有促进作用,SDS对木瓜酶水解酪蛋白反应则有较强的抑制作用,Tween-80对木瓜酶水解酪蛋白反应有一定的抑制作用。木瓜酶水解酪蛋白反应的米氏常数Km(37℃)大小顺序为:Km(papain-CTAB)>Km(papain)>Km(papain-Tween-80)>Km(papain-SDS)。
3、荧光光谱表征。(1)表面活性剂对木瓜酶荧光强度的影响:CTAB使木瓜酶荧光强度增强;SDS对木瓜酶的荧光强度有猝灭作用;Tween-80对木瓜酶的荧光强度的影响与其浓度有关,当CTween-80浓度分别为0.1CMC、1CMC时,Tween-80对木瓜酶的荧光有增强作用,当浓度大于1CMC后,Tween-80对木瓜酶的荧光有猝灭作用。(2)表面活性剂对木瓜酶荧光峰位置的影响:CTAB使木瓜酶的荧光峰红移;SDS对木瓜酶荧光峰位置的影响与其浓度有关,当CSDS=0.1CMC时,SDS使木瓜酶荧光峰红移,而当CSDs≥1CMC后则发生蓝移;Tween-80对木瓜酶荧光峰位置的影响与其浓度有关,当CTween-80浓度分别为0.1CMC、1CMC时,Tween-80使木瓜酶的荧光峰发生红移,CTween-80>1CMC后,木瓜酶的荧光峰位置稍有蓝移。
4、拉曼光谱表征。(1)表面活性剂对木瓜酶二级结构的影响:木瓜酶的构象以β-折叠和无规卷曲为主,α-螺旋和回转构象的含量较少;CTAB的加入使木瓜酶的α-螺旋构象含量增加,回转构象消失;SDS、Tween-80则使木瓜酶的α-螺旋和回转构象含量有所增加,而β-折叠和无规卷曲构象含量减少。(2)表面活性剂对木瓜酶三级结构的影响:木瓜酶中所有19个酪氨酸都处于暴露状态;加入CTAB后,16个酪氨酸处于暴露状态,3个处于埋藏状态;而加入SDS和Tween-80后,木瓜酶的酪氨酸处于埋藏状态;CTAB和 Tween-80使木瓜酶的色氨酸趋于暴露状态,而SDS则使色氨酸埋藏;木瓜酶的C-S-S-C构象为扭曲—扭曲—扭曲、扭曲—扭曲—反式,CTAB,SDS和Tween-80均使其构象除了扭曲—扭曲—扭曲、扭曲—扭曲—反式构象外,增加了反式—扭曲—反式构象。
5、圆二色(CD)表征。(1)CTAB对木瓜酶二级结构的影响:当CCTAB≤2.5mmol·L-1时,木瓜酶的α-螺旋构型含量随浓度的增大而增大,β-折叠构型含量随浓度增加先减小后增大,在1.5mmol·L-1(约1CMC)处出现极小值;回转构型含量基本上随浓度增大而减小,无定形构型含量则随浓度增大先增大后减小,在1.5mmol·L-1处出现极大值。当CCTAB>2.5mmol·L-1后,CTAB对木瓜酶的有序结构会产生破坏作用。(2)SDS对木瓜酶二级构象的影响:当CSDS<1CMC,木瓜酶的α-螺旋、β-折叠、回转等有序结构的含量减少而无定形结构含量增加。当CSDs≥1CMC后,木瓜酶的α-螺旋、β-折叠构型含量有所增加,回转、无定形构型含量则有所减少。(3)Tween-80对木瓜酶二级构象的影响:当CTween-80<1CMC时,木瓜酶的α-螺旋、无定形构型含量减少,β-折叠、回转构型含量增加;当CTween-80=1CMC,木瓜酶的α-螺旋、无定形构型含量增加,而β-折叠、回转结构含量减少;CTwee-80>1CMC四种构型的含量基本不再随Tween-80浓度的变化而变化。