由草鱼呼肠孤病毒所引发的草鱼出血病,极大地危害中国淡水养殖业的健康持续发展。针对草鱼呼肠孤病毒分子结构及基因功能的研究是明确病毒侵染宿主机制的基础,而对草鱼呼肠孤病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用研究则是攻克草鱼出血病的重点和难点。热休克蛋白70(HSPs)具有辅助增强蛋白质折叠,协助蛋白质复合物组装,帮助蛋白质跨膜并纠正蛋白质折叠不当和聚集等功能。在哺乳类中,正常状态下Hsc70高表达受到刺激后表达量进一步增加,与细胞的发育、分化紧密相关,为组成型蛋白;而Hsp70在正常生理状态条件下不表达或存在量较少,但是机体受外界刺激胁迫条件时其表达量迅速增加,具有细胞保护功能,为诱导型蛋白。与Hsc70不同,哺乳动物的Hsp70已被确认为促进等许多病毒的关键性宿主因子。但是还没有研究证实鱼Hsp70是否能促进任何水生呼肠孤病毒的感染。基于此,本研究包含了以下三个方面:1.Ⅲ型GCRV非结构蛋白基因NS66的原核表达,多克隆抗体的制备使用PCR法扩增GCRV104株s6基因片段,并克隆到表达载体p GEX-4T-3,转化至BL21大肠杆菌后用IPTGda诱导表达大量融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定分析产物大小后,使用尿素纯化不可溶蛋白获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白p GEX-4T-3-NS66免疫注射小鼠,获得Anti pGEX-4T-3-NS66多克隆抗体,使用Western blot方法测定制备的抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)方法鉴定抗体特异性是否良好。SDS-PAGE分析发现表达的重组蛋白约66 k D,大小与预期估计相符,蛋白主要存在于包涵体中;Western blot显示制备的多克隆抗体效价大于1 50 000,Western blot和IFA结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV104病毒。由GCRV104病毒编码的非结构蛋白NS66可能参与了病毒复制和组装过程,形成了病毒包涵体,这为建立GCRV104免疫学诊断方法以及研究GCRV编码的NS66蛋白的功能奠定了前期工作基础。2.草鱼热休克蛋白HSPs对Ⅲ型GCRV的应激表达首先制备了可以将Hsp70与同源蛋白Hsc70区分的特异性抗体,利用实时荧光定量和western blot等方法证实正常条件下草鱼HSC70高表达,病毒感染过程中上调不明显;草鱼HSP70正常条件下不表达,在病毒感染后持续被诱导增加。HSP家族同源蛋白HSP30表达模式与HSP70一致,HSP90表达模式与HSC70一致。对HSP70蛋白进行抑制或者过表达处理,检测到的病毒表达量也会同步降低或增加。表明Hsc70和Hsp70的表达模式与它们在哺乳动物中的同源物相似。说明草鱼HSP70蛋白对病毒复制具有一定的促进作用。3.草鱼热休克蛋白HSPs的可能性调控机制为进一步明确草鱼HSP70蛋白如何参与免疫反应系统调控,我们将HSP70、HSC70与酵母表达载体连接,且试验构建的p GADT7-HSC70或p GADT7-HSP70质粒在酵母中不存在自激活作用,用p GADT7-HSC70或p GADT7-HSP70质粒作诱饵分别与GCRV104基因片段定向筛选并未发现阳性菌落,说明HSP70和HSC70可能与GCRV104表达的蛋白不存在直接相互作用。因缺乏热休克蛋白与草鱼呼肠孤病毒相互作用的直接证据,为验证热休克蛋白的转录翻译调控是否不通过病毒介导而与非正常折叠蛋白通路被激活相关的假设,我们检测了UPR上的关键性指标因子。结果表明,病毒感染过程中,XBP1S、ATF4、ATF6、GRP94均没有被显著诱导差异,仅GRP78在病毒感染144h被诱导增加10倍转录量。综上,病毒GCRV-104感染下Hsp70表达上调并非是通过非正常折叠蛋白通路的激活。