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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种常见的条件致病菌,广泛存在于水环境中,能导致多种淡水鱼暴发出血性败血症,也能引起人类食物中毒、感染性腹泻、败血症等。Ⅵ型分泌系统（T6SS）是许多革兰阴性菌用于靶向真核宿主细胞或者其他细菌的一种多功能武器,在细菌的毒力作用和细菌间竞争过程中发挥重要作用。溶血素共调节蛋白（Hcp）是T6SS的重要结构成分和效应分子,其分泌被认为是T6SS发挥功能的标志。然而到目前为止,T6SS在嗜水气单胞菌的功能仍未被报道过。本研究对已完成全基因组测序的14株嗜水气单胞菌进行了生物信息学分析,发现T6SS基因簇在嗜水气单胞菌不同分离株中具有多样性;在此基础上,分别对嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35和美国分离株ML09-119的T6SS效应分子Hcp进行了功能分析,并评价了重组Hcp蛋白在常见淡水养殖鱼类—鲫鱼中的免疫原性和保护效力;同时,对嗜水气单胞菌NJ-35中的一组新型抗菌效应蛋白/免疫蛋白对TseP/TsiP进行了鉴定及功能分析。1.嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35 T6SS基因簇的鉴定及Hcp家族蛋白多样性分析对已完成全基因组测序的14株嗜水气单胞菌进行生物信息学分析。结果显示,除GYK1外,其余6株中国分离株均含有1个T6SS基因簇,而在7株美国分离株中,除ATCC 7966和AHNIH1外均未发现该基因簇的存在。嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35 菌株培养上清中 Hcp 的存在,提示在 NJ-35 中存在着功能性的 T6SS。并发现低温条件可强烈诱导嗜水气单胞菌Hcp的分泌。在NJ-35基因组中存在hcp基因的3个拷贝,其中有1个位于T6SS基因簇内,另2个位于基因簇外。为进一步研究效应分子Hcp在NJ-35中的作用,本试验利用同源重组技术构建了hcp的单基因、双基因及三基因缺失株;并在此基础上,分别构建了相应的互补株。另外,还构建了 hcp基因的交叉互补株。研究结果表明hcp1在NJ-35菌株中Hcp的表达和分泌中发挥重要作用:当hcp1基因被敲除后,hcp3可能起到一定的补充作用,而hcp2在体外培养条件下并不表达。提示,Hcp1可能与T6SS的组装和分泌功能相关。2.Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌中国分离株NJ-35致病及环境适应过程中的作用对嗜水气单胞菌NJ-35野生株、hcp基因缺失株及互补株进行生物学特性分析。结果表明,Hcp1对于T6SS的组装是必需的,并且在细菌间竞争过程中发挥关键作用;Hcp2负调控细菌的生物被膜形成能力和对真核细胞的黏附能力,同时促进细菌对斑马鱼的毒力作用和抗四膜虫的捕食能力;Hcp3正调控细菌的生物被膜形成能力和黏附能力。上述结果表明,在嗜水气单胞菌NJ-35中存在功能性的T6SS,并且这3个Hcp在NJ-35的致病及环境适应过程中发挥着不同的作用。3.Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌美国分离株ML09-119致病及环境适应过程中的作用对嗜水气单胞菌美国分离株ML09-119全基因组序列进行分析,发现该菌株中不存在T6SS基因簇,但含有2个hcp基因。为探究ML09-119中hcp的功能,本研究分别构建了 ML09-119的hcp-1和hcp-2单基因及双基因缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,在体外培养条件下,美国分离株ML09-119的hcp-2可检测到转录,而hcp-1未发生转录。对野生株和缺失株的生物学特性分析结果表明,在ML09-119中,hcp-1和hcp-2均不参与细菌的运动性、生物被膜形成及细菌间竞争作用。在动物感染试验中,野生株及hcp-2单基因缺失株注射鲶鱼分别在30 h和36 h内全部死亡。而hcp-1单基因缺失株及hcp-1和hcp-2双基因缺失株注射鲶鱼在48 h内并未全部死亡,存活率分别为40%和30%;并且在感染后12 h时,这两株缺失株在鲶鱼肾脏中的载量均显著下降,hcp-1单基因缺失株在鲶鱼肝脏中的载量也显著降低。上述结果表明,hcp-1参与ML09-119对鲶鱼的致病作用。4.嗜水气单胞菌NJ-35 hcp1基因缺失株和野生株的比较蛋白质组学分析hcp1基因缺失株对HEp-2细胞的黏附能力相较于野生株出现显著性降低（P<0.001）。利用非标记定量蛋白质组学技术检测hcp1单基因缺失株与NJ-35野生株细胞外膜蛋白样品中的差异表达蛋白,共鉴定到23个上调表达蛋白和30个下调表达蛋白。其中,包括一些与细胞黏附作用相关的蛋白,如鞭毛形成相关蛋白、菌毛形成相关蛋白以及外膜蛋白等。实时荧光定量PCR验证结果显示,在hcp1单基因缺失株中,Ⅰ型菌毛形成相关基因fimC和fimD的转录水平均显著下调（P<0.001）,提示hcp1可能通过调控fimC、fimD等基因的表达来影响细菌的黏附性。5.嗜水气单胞菌Hcp重组蛋白的鲫鱼免疫效果分析疫苗免疫是预防运动性气单胞菌败血症（MAS）及其它常见疾病发生的有效方法,对于水产养殖产业的可持续增长十分重要。本研究分析了hcp基因在240株气单胞菌分离株中的分布情况,制备了NJ-35 Hcp的重组蛋白,并分析了该蛋白在中国常见淡水养殖鱼类-鲫鱼中的免疫原性和保护效力。PCR检测结果显示,hcp基因在多种气单胞菌中均有分布,尤其是在嗜水气单胞菌中（39/39）。免疫印迹分析结果表明Hcp在不同血清型嗜水气单胞菌中的表达比较保守。攻毒鲫鱼10天后,与未免疫组（7.14%）相比,重组Hcp蛋白免疫组的存活率（46.67%）显著提高。疫苗免疫组血清IgM抗体水平以及肾、脾和鳃组织中的白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的表达水平均显著上升。以上结果表明重组Hcp蛋白有望成为预防嗜水气单胞菌感染的候选疫苗靶蛋白之一。6.嗜水气单胞菌NJ-35新型抗菌效应蛋白/免疫蛋白对TseP/TsiP的鉴定及功能分析T6SS可通过效应蛋白的递送而发挥对其他细菌细胞或真核细胞的毒力作用。本研究利用生物信息学分析技术在14株嗜水气单胞菌全基因组中鉴定出多组含有毒素结构域的潜在效应蛋白及其下游同源免疫蛋白。并首次在嗜水气单胞菌NJ-35中鉴定出一组新型抗菌效应蛋白/免疫蛋白对TseP/TsiP。TseP由U87611145所编码,携带一个S型脓菌素（PyocinS）结构域。为探究NJ-35中TseP的功能,本研究构建了tseP和tsiP基因的缺失株和相应互补株。发现在NJ-35中,tseP和tsiP基因的缺失使得细菌的生物被膜形成能力显著上升,而并不影响细菌的运动性和抗四膜虫吞噬能力。细菌竞争试验结果显示,NJ-35野生株对ΔtsePtsiP和大肠杆菌均具有明显的杀伤作用（P<0.001）;tseP基因的缺失显著减弱了 NJ-35对ΔtsePtsiP的杀伤作用（P<0.01）,而并未降低NJ-35对大肠杆菌的杀伤作用,提示TseP可能参与嗜水气单胞菌种内竞争作用。该试验结果还表明,TseP的抗菌作用依赖于T6SS,其同源免疫蛋白TsiP可保护自身细菌免于TseP的杀伤作用。综上所述,T6SS基因簇在嗜水气单胞菌不同分离株中具有多样性,T6SS效应分子Hcp家族蛋白在嗜水气单胞菌NJ-35致病及环境适应过程中发挥着不同的作用,本研究为研究细菌如何利用T6SS介导微生物间的相互作用提供了新的思路。