妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorder complicating pregnancy, HDCP)是妊娠期特有疾病,病因和发病机制尚未完全阐明,已有研究表明,转化生成因子TGFβ1及其受体与妊娠期高血压疾病发生的中心环节--血管内皮损伤及胎盘血管重铸过程密切相关,本研究将通过观察TGFβ1及其可溶性受体成份-sEng对体外培养的脐静脉内皮细胞及滋养细胞的影响,探讨其在妊娠期高血压疾病发生、发展中的作用。第一部分sEng及TGFβ1与内皮细胞损伤的相关性研究目的：观察可溶性Endoglin (soluble endoglin, sEng)及转化生长因子β1(TGFβ1)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)增殖、凋亡的影响,及其对HUVEC产生一氧化氮(nitric oxide, NO)量,内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)1177位点丝氨酸磷酸化程度的影响,探讨sEng及TGFβ1参与内皮细胞损伤的可能机制。方法：体外培养HUVEC,将3代以内的HUVEC接种于96孔培养板,分4组：对照组(单纯RPMI-1640完全培养液培养)、sEng组、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)组：根据四甲基偶氮唑蓝(MTT)结果,将sEng组、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)组按加药浓度分别分为110、100μg/L三个亚组,收集6h、12h,24h时间点的细胞及培养液。ELISA法测定细胞培养液中sEng及TGFβ1含量;MTT比色法检测对照组、不同浓度sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)培养6h、12h、24h后HUVEC的细胞的存活率,流式细胞技术观察各组凋亡率和细胞周期分布；硝酸酶还原法测定细胞培养液中NO含量,Western印迹法检测各组细胞eNOS蛋白相对表达量及其1177位点丝氨酸磷酸化情况,实时荧光PCR检测各组细胞eNOS mRNA的相对表达量。结果：(1)细胞培养液中sEng及TGFβ1的含量：24h、48h、72hHUVEC培养液中未测得sEng;24h、48h、72h细胞培养液中TGFβ1含量分别为(3.12±0.78)、(3.33±0.91)、(3.08±0.87)ng/L,三个时间段TGFβ1含量无明显变化(F=2.10,p>0.05)。(2)细胞存活率：sEng组HUVEC存活率在各个浓度点及时间点均低于对照组和其它各组,且与时间和加药浓度均呈负相关;TGFβ1组,加1μg/L时HUVEC表现为增殖,存活率高于对照组,加10、100μg/L时,HUVEC存活率与时间和加药浓度均呈负相关(sEng+TGFβ1)组HUVEC存活率与对照组比较无显著性差异,无时间及浓度依赖性。(3)细胞凋亡率和周期分布：sEng组,HUVEC凋亡率明显增加,与加药浓度及作用时间均呈正相关,sEng组G1期细胞比例显著高于对照组,亦与浓度及时间呈正相关；TGFβ1各组HUVEC凋亡率与对照组各点比较均无明显差异,1μg/L组G1期细胞比例显著低于对照组并与作用时间呈负相关,10、100μg/L组G1期细胞比例显著高于对照组且与作用浓度及时间呈正相关；(sEng+TGFβ1)组HUVEC凋亡率、G1期细胞比例、存活率与对照组比较无显著性差异,且无浓度及时间依赖性。(4)细胞培养液中NO含量变化：对照组培养液内NO含量24h内无明显变化(F=2.30,p>0.05), sEng组细胞培养液中NO含量低于对照组和其它各组并与作用时间和加药浓度均呈负相关;TGFβ1组,加1gg/L时,细胞培养液中NO含量显著高于对照组及其它各组,与作用时间呈正相关,加10、100gg/L时,细胞培养液中NO含量与时间和加药浓度均呈负相关；(sEng-TGFβ1)组细胞培养液中NO含量与对照组比较无显著性差异,亦无时间及浓度依赖性。(5) eNOS蛋白及mRNA表达水平变化：sEng组,HUVEC eNOS蛋白及mRNA表达在各个时间点及浓度点均低于对照组及其它各组,且与作用时间及加药浓度呈明显的负相关;TGFβ1组,加1μg/L时eNOS蛋白及mRNA表达水平在各个时间点均高于对照组及其它各组,且与时间呈正相关,加10、100μg/L时,eNOS蛋白及mRNA表达水平在各个浓度点及时间点均低于对照组但高于sEng组,且与作用时间及浓度呈负相关(sEng+TGFβ1)组各个时间点及浓度点细胞eNOS蛋白及mRNA表达水平与对照组比较无显著性差异。(6) eNOS蛋白活化情况：sEng组,eNOS-Ser(p)1177/eNOS在各个时间点及浓度点均低于对照组及其它各组,并与作用时间及加药浓度呈负相关；TGFβ1组,加1μg/L时eNOS-Ser(p)1177/eNOS在各个时间点均高于对照组及其它各组并与时间呈正相关,加10、100μg/L时,eNOS-Ser(p)1177在各个浓度点及时间点均低于对照组但高于sEng组,且与时间及浓度呈负相关;(sEng+TGFβ1)组各个时间点及浓度点细胞eNOS-Ser(p)1177/eNOS与对照组比较无显著性差异。结论：1、加入外源性sEng可与内源性产生的TGFβ1结合阻断TGFβ1的信号传导,通过促进凋亡,并使细胞受阻于G1期,延缓其从Gl期向S期过渡的方式,抑制HUVEC的增殖.同时通过下调eNOS1177位点丝氨酸的磷酸化水平,抑制eNOS的活性,使HUVEC分泌NO功能下降,进而影响内皮细胞的舒缩功能。2、加入外源性的TGFβ1,对HUVEC的影响取决于作用浓度.高浓度TGFβ1主要通过使内皮细胞受阻于G1期.延缓其从G1期向S期过渡的方式,抑制HUVEC的增殖,同时通过下调eNOS1177位点丝氨酸的磷酸化水平,抑制eNOS的活性,使HUVEC分泌NO的能力下降,影响内皮细胞的舒缩功能,低浓度的TGFβ1对HUVEC的作用与之相反。3、(sEng+TGFβ1)组HUVEC的增殖、eNOS活性、NO的产生与对照组比较无显著差异,说明两因子等量加入细胞培养液,sEng作为TGFβ1的受体,二者几乎达到1：1结合,结合后二者均不能发挥前述作用,推断受体与配体成比例结合有助于内皮细胞发挥正常的作用,任一因子过量使比例失调,则对HUVEC产生不同程度的影响,进而参与内皮细胞功能的紊乱。第二部分sEng与TGFβ1对人早孕绒毛膜滋养细胞增殖及浸润的影响目的：探讨可溶性Endoglin与TGFβ1对人早孕绒毛膜滋养细胞增殖能力和浸润功能的影响。方法：采用胰蛋白酶-DNase消化法培养人早孕期(孕6-8周)绒毛膜滋养层细胞,将3代以内的滋养细胞接种于96孔培养板,分4组：对照组(单纯DMEM完全培养液培养)、sEng组、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)组ELISA法测定细胞培养液中sEng及TGFβ1含量；MTT法观察滋养细胞的增殖情况并确定后续试验中sEng、TGFβ1及(sEng-TGFβ1)(?)的加药浓度及作用时间：MTT法观察各组细胞存活率,流式细胞技术观察各组细胞的细胞周期变化,Transwell技术检测各组滋养细胞的浸润功能；Western印迹法检测各组滋养细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达；RT-PCR法检测各组滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA的表达。结果：24h、48h、72h滋养细胞培养液中未测得sEng:24h、48h、72h细胞培养液中TGFβ1含量分别为(5.03±0.54)、(4.09+0.27)、(5.91+0.68)ng/L,三个时间段TGFβ1含量无明显变化(F=3.09,p>0.05);10μg/LsEng、TGFβ1分别作用6h、12h、24h,各组细胞存活率与对照组比较均无明显差异：作用36h、48h,存活率明显降低,分别为(71.44±6.07)%、(51.44±6.34)%(36h),(62.37±8.12)%、(23.48±4.36)%(48h),无明显的时间及浓度依赖性;(sEng+TGFβ1)组滋养细胞存活率在各个时间点及浓度点与对照组比较无明显差异.确定各组加药浓度为10μg/L;作用48h,各组均未见明显凋亡;sEng组G1期细胞比例(88.24±2.11)%显著高于对照组(55.23±1.22)%%但低于TGFβ1组(95.63±2.98)%,(均p<0.05);TGFβ1组G1期细胞比例显著高于其它各组(均p<0.05);(sEng+TGFβ1)组G1期细胞比例(58.11±1.25)%与对照组比较无明显差异；各组加药10μg/L、作用24h, sEng组滋养细胞穿透Transwell基底膜的细胞数为(87+6.3)个/5HP显著低于对照组(143±41.3)个/5HP, TGFβ1组滋养细胞穿透Transwell基底膜的细胞数为(157-±-55.9)个/5HP显著高于对照组,而(sEng+TGFβ1)组细胞穿透数与对照组比较无显著性差异(p>0.05)。sEng组滋养细胞MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达明显低于对照组,TGFβ1组滋养细胞MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达明显高于对照组,差异均有统计学意义(均p<0.05),而(sEng+TGFβ1)组MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达与对照组无显著差异(p>0.05)。结论：sEng和TGFβ1可能通过调节滋养细胞的G、期细胞比例,影响其增殖能力,但并不导致细胞的死亡;通过调节滋养细胞MMP-2和MMP-9的表达影响其浸润能力；在体外细胞培养环境下,sEng和TGFβ1可达到1:1的结合,并失云各自对滋养细胞的影响,据此推测,早孕期绒毛局部两种因子比例失调,可能不同程度的影响滋养细胞向子宫肌层的正常浸润,造成“胎盘浅着床”引起妊娠期高血压等相关疾病。