第一部分 CHIP降解tau蛋白特性研究 神经原纤维缠结(NFTs)是阿尔茨海默病典型的脑病理特征之一，构成NFTs的主要成分是异常磷酸化的tau蛋白。最近研究发现：CHIP(carboxylterminusofHsc70-interactingprotein)是tau蛋白特异性的泛素连接酶3。在体外，CHIP可以促进tau蛋白的降解。但在体CHIP降解tau蛋白的特性还不清楚。另外，CHIP介导tau蛋白泛素化的方式目前还存在争议。在我们的研究中，用立体定位注射技术将CHIP质粒导入大鼠双侧海马来研究CHIP对tau蛋白的降解特性。在CHIP质粒注射后，在24小时内CHIPmRNA和蛋白表达水平都呈时间依赖性的显著升高。同时，CHIP质粒转染鼠脑中总tau蛋白以及在PHF-1位点磷酸化和在tau-1位点非磷酸化的tau蛋白水平均显著下降，且这种下降和CHIP的增加负相关。CHIP蛋白表达增加并不影响tau蛋白的mRNA水平和蛋白酶小体的活性。以上结果提示在正常大鼠脑内CHIP可以调节tau蛋白的降解且不依赖与tau蛋白的磷酸化状态。我们进一步检测CHIP能否降解异常磷酸化的tau蛋白。通过侧脑室注射wortmannin和GFX来复制tau蛋白磷酸化的动物模型。我们发现和模型组相比，在CHIP过表达的鼠脑内，在PHF-1位点过度磷酸化的tau蛋白水平显著下降，而CHIP并不抑制wortmannin/GFX诱导的GSK-3β的激活。以上结果提示：在鼠脑内CHIP过量表达可以促进异常磷酸化tau蛋白的降解。用激酶GSK3β的激活剂wortmannin或酯酶抑制剂岗田酸(OA)处理N2a细胞以诱导AD样tau蛋白磷酸化的细胞模型，同时在N2a细胞瞬时转染CHIP质粒，免疫荧光结果显示过量表达CHIP可以降低tau蛋白在pS214和pS396位点的磷酸化水平并显著抑制磷酸化tau蛋白的聚积。以上结果提示过量表达CHIP可以促进异常磷酸化tau蛋白的降解。免疫共沉淀发现tau蛋白、Hsc70和CHIP二聚体共存。为确定在CHIP和tau蛋白的相互作用中是否需要Hsc70，我们首先将大鼠海马匀浆液用结果发现：用Hsc70抗体进行免疫沉淀去除Hsc70后，再用tau蛋白的抗体进行免疫沉淀仍然可以观察到tau蛋白和CHIP二聚体复合物。以上结果提示在没有Hsc70的情况下，CHIP二聚体仍可和tau蛋白直接相互作用。CHIP二聚体可能通过一种新的非Hsc70依赖的方式来发挥其作用。氯化锂可以在细胞水平上调CHIP蛋白的表达。总之，我们的结果首次提供在体证据：二聚体CHIP在生理和病理条件下对tau蛋白的降解都是很关键的，二聚体CHIP可能通过非Hsc70依赖性的方式发挥作用。过表达CHIP可能是抑制NFTs形成的潜在治疗手段之一。 第二部分一氧化氮通过激活GSK-3β诱导tau蛋白磷酸化 AD病人脑内的典型病理特征之一是神经原纤维缠结(NFTs)，其主要是由异常磷酸化的tau蛋白组成。在NFTs中，可检测到一氧化氮(Nitricoxide，NO)的存在。但是NO与tau蛋白磷酸化的关系尚不清楚。我们的研究发现：由广泛应用的NO的供体硝普钠(odiumnitroprusside，SNP)产生的NO，在HEK293/tau441细胞中可以诱导tau蛋白在Ser396/404andSer262位点发生磷酸化，同时可检测到糖原合酶激酶(glycogensynthasekinase-3β，.GSK-3β)的激活。在SNP处理细胞前用GSK-3的抑制剂10mM的氯化锂(lithiumchlorideLiCl)预处理1个小时，则可以抑制由SNP诱导的tau蛋白的磷酸化改变和GSK-3β的激活。本实验首次证明在体外NO可以诱导AD样tau蛋白磷酸化，GSK-3β的激活是NO诱导tau蛋白磷酸化的机制之一。NO可能是在AD病人脑内导致tau蛋白磷酸化的上游因子。 第三部分 大鼠皮质双向电泳样品制备方法的优化 目的优化大鼠皮质双向电泳样品制备方法，初步建立双向电泳条件，提高电分辨率和重复性。方法分别应用三氯乙酸/丙酮沉淀法、超速离心法及改良超速离心法制备电泳样品，并比较各处理方法对电泳的影响。结果采用将混合了匀浆液Ⅱ的匀浆物4℃放置过夜后再进行后续处理的改良超速离心法所制备的电泳样品，不仅可以减少蛋白的降解，还可以增加蛋白的溶解性，从而获得分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱。结论改良离心法更适于制备来源于中枢神经系统双向电泳样品。