胰蛋白酶是一种重要的蛋白酶,在医药、皮革加工、食品工业及农业领域具有重要应用价值。目前市售胰蛋白酶仍以动物源为主,受到制备成本高、动物性病毒风险以及宗教问题等因素制约,导致其应用存在限制。微生物源胰蛋白酶可以有效解决上述问题,且微生物发酵生产胰蛋白酶具有生产成本低、产量和酶活高、制备简便等特点。然而,目前多数研究仍主要围绕动物源胰蛋白酶展开,微生物胰蛋白酶的潜力还远未得到开发。本论文从某皮革厂采集样品,以脱脂奶粉为唯一碳氮源初筛产蛋白酶的菌株,再通过摇瓶发酵复筛,结合特异性酶活检测筛选获得8株具有较高胰蛋白酶活性的菌株,并择其中一株产酶达20 U·m L-1的菌株DMN6进行后续研究。通过生理生化与16S r DNA分子鉴定,将该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。通过单因素实验对菌株DMN6产酶条件进行优化,结果表明,该菌株产胰蛋白酶的最优条件为,玉米粉15 g·L-1,大豆蛋白胨15 g·L-1,磷酸氢二钾7 g·L-1,磷酸二氢钾3 g·L-1,三氯化铁5 mmol·L-1,氯化镁15 mmol·L-1,接种量为1%,37℃下培养84 h,优化后的发酵酶活可达140 U·m L-1,相比优化前提高了7倍。采用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Superdex 75凝胶层析对发酵液中胰蛋白酶进行分离纯化,纯化后胰蛋白酶回收率为24.5%,纯化倍数为8.5倍,比酶活可达350.0 U·mg-1。SDS-PAGE分析显示,其分子量为44 k Da。对纯化后的胰蛋白酶进行酶学性质表征,结果表明,该酶的最适反应温度为65℃,最适p H为9.0,并表现出良好的温度和p H适应范围。该酶在45℃下仍能保持85%以上的酶活,且具有良好的稳定性,表明该酶在较低温度的工业条件下具有较好前景。Ba2+在低浓度下对该胰蛋白酶活性有明显的促进作用,而其它多数金属离子则表现出一定抑制作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF可以强烈抑制该酶的活性,说明该酶为丝氨酸蛋白酶类。表面活性剂对酶具有一定抑制作用。以BAEE为底物测定其酶促反应动力学参数,结果显示Km和Vmax分别为0.75 mmol·L-1和184 U·m L-1。