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背景目前ST段抬高型MI在介入术后,3年死亡率仍高达25%,心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是目前影响MI冠脉血运重建治疗疗效的主要制约因素。炎症反应过度激活是促进心肌I/R损伤发生发展的主要因素之一,在心肌I/R损伤的早期炎症期,天然免疫应答的激活是炎症反应的重要组成部分。已知,心肌细胞TLR2/TLR4介导的细胞内信号转导在天然免疫应答中亦发挥着重要作用,而且近期有研究报道Pellino1蛋白对TLR2/TLR4介导的信号通路具有调控作用。本课题组的前期研究发现,Pellino1蛋白可以通过调节TLRs/IL-1R介导的信号通路中的关键信号分子TRAF6影响NF-κB的结合活性,从而对MI的发生发展及心梗后心室重塑发挥调控作用。然而,心肌持续缺血所致MI及心梗后心室重塑的机制并不能推广解释心肌I/R损伤的发生机制。而且,心肌组织中的心肌细胞、心肌成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞等多种心脏内固有细胞及血管中游走出的炎症细胞均有可能在I/R损伤的发展进程中发挥作用,哪些细胞内的Pellino1蛋白可以在其中发挥调控作用也有待阐明。因此,本研究将采用Pellino1心肌细胞条件性敲除小鼠和沉默体外培养的原代心肌细胞Pellino1表达的方法,着重研究心肌细胞Pellino1蛋白是否在心肌I/R早期损伤中发挥作用,并探讨其调控机制。目的明确心肌细胞内Pellino1是否对心肌I/R早期损伤及心肌细胞H/R具有调控作用并初步阐明Pellino1发挥调控作用的机制。方法1.在体动物实验通过结扎冠状动脉左前降支45min后再灌注的方法复制小鼠心肌I/R模型。为了解Pellino1与心肌I/R早期损伤的相关性,取同周龄体重的雄性C57/BL6小鼠进行试验。实验分组:假手术组(Sham),缺血-再灌注组(I/R)。为研究心肌细胞内Pellino1对心肌I/R早期损伤是否具有调控作用,采用Cre-LoxP系统构建的Pellino1心肌条件性敲除小鼠,取同周龄体重的雄性小鼠随机分为四组进行手术:对照假手术组(Peli1Flox/Flox sham)、对照缺血-再灌注组(Peli1Flox/Flox I/R)、Pellino 1 心肌条件性敲除小鼠假手术组(Peli 1cKO sham)、Pellino1心肌条件性敲除小鼠缺血-再灌注组(Peli1cKO I/R)。2.体外细胞实验体外培养原代乳大鼠心肌细胞。采用缺氧/复氧(H/R)诱导心肌细胞H/R模型。通过转染腺病毒装载的shPellino1(adv-shPeli1)沉默心肌细胞中Pellino1的表达,以研究Pellino1对H/R刺激诱导的心肌细胞炎症因子合成及心肌细胞凋亡的调控作用及其机制。实验分为四组:对照组(Con)、缺氧/复氧组(H/R)、转染无关序列adv-ShScr的缺氧/复氧组(H/RAdshScr)、转染adv-ShPeli1的的缺氧/复氧组(H/R AdshPeli1)。3.检测指标Western Blot及rt-PCR实验验证Pellino1与心肌I/R早期损伤相关性;超声心动图检测小鼠心功能,主要是左室收缩功能,最重要的指标有射血分数(EF)以及缩短分数(FS);Evans Blue-TTC染色评估术后心肌梗死面积的大小;缺血45min再灌注24h后检测心肌组织中MPO活性以评估中性粒细胞浸润程度;F4/80免疫组化染色检测缺血45min再灌注3d后心肌组织内巨噬细胞的浸润程度;心肌组织Tunel染色以评估缺血45min再灌注3d后心肌组织内细胞凋亡数量。Tunel染色及Western Blot实验检测cleaved-caspase3蛋白表达水平以评估体外培养的原代心肌细胞凋亡情况;rt-PCR实验检测心肌细胞内炎症因子IL-1、IL-6、TNF-αmRNA 水平。结果一、心肌细胞内Pellino1对心肌缺血/再灌注早期损伤的调控作用1.心肌缺血45min再灌注3d后,心肌组织中Pellino1蛋白表达水平以及mRNA水平明显增加,提示心肌I/R损伤早期诱导心肌组织内Pellino1表达增加。2.心肌缺血45min再灌注3d后小鼠心功能明显下降,心肌梗死灶明显。心肌条件性敲除Pellino1,心肌I/R后小鼠心脏射血分数及缩短分数明显改善,梗死灶面积也显著减小,表明Pellino1心肌条件性敲除可以减轻心肌I/R损伤并改善心功能。3.心肌缺血45min再灌注24h后,心肌组织中中性粒细胞特有的MPO活性明显增加,提示心肌I/R24h后中性粒细胞大量浸润心肌组织。而心肌条件性敲除Pellino1,心肌I/R24h后MPO活性显著下降,表明Pellino1心肌条件性敲除可以减轻心肌I/R 24h后心肌组织中的中性粒细胞浸润程度。4.心肌缺血45min再灌注3d后,心肌组织内巨噬细胞浸润程度明显增加,而心肌条件性敲除Pellino1可以明显减少巨噬细胞的浸润。5.心肌缺血45min再灌注3d后,心肌组织内细胞凋亡数量明显增加,心肌条件性敲除Pellino1可减少细胞凋亡数量。提示Pellino1心肌条件性敲除可以明显减少心肌I/R损伤所诱导的细胞凋亡。二、Pellino1对H/R诱导的心肌细胞炎症因子表达及心肌细胞凋亡的调控作用及其机制1.H/R可明显增加心肌细胞内Pellino1蛋白的表达,同时心肌细胞内炎症因子IL-1、IL-6、TNF-αmRNA水平也明显增加,并可诱导心肌细胞发生凋亡。沉默心肌细胞Pellino1表达可使心肌细胞内炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α mRNA水平显著降低,而且心肌细胞的凋亡数量也明显减少。表明沉默心肌细胞Pellino1表达对H/R诱导的心肌细胞损伤具有保护作用。2.H/R可诱导心肌细胞内cIAP2泛素化水平增加,同时伴有TRAF3的K-48位点泛素化水平增加和TRAF3蛋白表达水平的下降,提示H/R诱导了心肌细胞内TRAF3的降解。沉默心肌细胞内Pellino1可抑制H/R诱导的cIAP2泛素化修饰和TRAF3 K-48泛素化修饰,从而减少TRAF3降解。3.对MAPK信号通路中重要成员JNK、p-38、ERK的检测发现,心肌细胞H/R可导致P-JNK、P-p-38、P-ERK水平增加,表明H/R激活了细胞内MAPK信号通路。沉默心肌细胞内Pellino1表达可下调H/R诱导的P-p-38、P-ERK表达的增加,从而抑制MAPK信号通路的激活。结论结合在体动物及体外细胞实验结果,揭示心肌细胞内Pellino1对心肌I/R早期损伤具有调控作用。Pellino1调控心肌I/R早期损伤的机制可能与其对cIAP2/TRAF3/MAPK信号通路的调节有关。本论文研究结果有助于阐释心肌I/R早期损伤的病理生理学机制,为寻找防治心肌I/R损伤的新方法提供理论依据。