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植物下胚轴顶钩(apical hook)具有保护其子叶和顶端分生组织在出土时免受机械损伤的功能。最近的研究表明,生长素输出载体PIN3(PIN-FORMED3)和生长素输入载体AUX1/LAX3(AUXIN RESISTANT1/LIKEAUX1(LAX)3)共同参与调控生长素最大峰值(auxin maxima)的建立,而生长素最大峰值的建立是拟南芥下胚轴顶钩形成的必要前提,但具体的调控机理目前仍不清楚。 本研究的前期工作已经成功分离鉴定了拟南芥网格蛋白轻链clc2-1 clc3-1双突变体,发现了CLC2和CLC3功能缺失抑制PIN蛋白内吞。为此,本研究综合运用遗传学、细胞生物学和药理学等研究手段,初步剖析了网格蛋白在下胚轴顶钩形成和蓝光诱导的顶钩打开过程中的生物学功能。具体研究结果如下: (1)在正常黑暗条件下,CLC2和CLC3功能缺失促进下胚轴顶钩内侧面(凹面)生长素最大峰值的建立和下胚轴顶钩的形成,但抑制了顶钩生长素最大峰值的消退和顶钩的打开,表明网格蛋白负调控下胚轴顶钩形成而正调控顶钩打开。 (2)生长素过量合成抑制生长素不对称分布和下胚轴顶钩形成。CLC2和CLC3功能缺失部分恢复了因生长素过量合成造成的生长素不对称分布和顶钩形成的抑制效应。这些结果进一步证实网格蛋白功能缺失的确能促进生长素不对称分布和下胚轴顶钩形成,同时也表明,生长素最大峰值的建立是顶钩形成的必要性前提。 (3)药理学分析表明,clc2 clc3双突变体下胚轴生长素最大峰值和顶钩形成对生长素输出抑制剂NPA和TIBA比野生型更敏感,但对生长素输入抑制剂1-NOA的敏感性与野生型相似,表明网格蛋白通过调控生长素极性输出而不是极性输入来调控下胚轴顶钩的形成。 (4)蓝光能有效地诱导生长素最大峰值消退和顶钩打开。CLC2和CLC3功能缺失抑制了蓝光诱导的顶钩打开和生长素最大峰值消退,表明蓝光诱导顶钩打开需要网格蛋白的功能。 (5)活细胞成像分析表明,CLC2和CLC3功能缺失影响了皮层细胞PIN3-GFP的内吞和质膜底端定位,但不影响AUX1的亚细胞定位,暗示CLC2和CLC3功能缺失通过抑制PIN3的内吞从而影响PIN3的重定位。这些结果进一步证实网格蛋白通过调控PIN3运输来调控顶钩形成和光诱导的顶钩打开。 综上所述,本研究初步获得以下结论:网格蛋白通过调控PIN3的极性定位和生长素的极性输出来调控生长素最大峰值的建立和下胚轴顶钩的形成以及蓝光诱导的顶钩打开,揭示网格蛋白参与调控植物暗形态发生和光形态发生。本研究为进一步剖析生长素调控下胚轴顶钩发育的分子机理提供新的见解,同时对正确理解植物暗形态发生和光形态发生的分子机制具有重要参考价值。