乳酰-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose,LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一,具有增强人体免疫力,调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(EFSA)、欧盟(EU)和美国食品药品管理局(FDA)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前,LNnT的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法,其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料,且以较低的环境代价获得高经济产出,因此具有更为广阔的应用前景。LNnT(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)是由D-半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖和D-葡萄糖依次连接组成的线性四糖,其合成途径较为复杂。目前生物合成法仍存在一些不足限制了产物的高效合成,如胞内的合成前体供给不足、合成途径与竞争途径之间代谢流不平衡、代谢压力过大可能影响菌株的遗传稳定性等。本论文以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)为研究对象,通过引入外源基因构建LNnT的合成途径;利用模块化工程优化前体合成途径,强化和平衡胞内前体的供给;进一步通过构建CRISPRi系统,降低竞争途径中关键基因的表达水平,实现产物的合成与细胞生长间代谢流的平衡,提高LNnT的合成效率;最后基于启动子工程和突变Spo0A启动子策略构建了一株无芽孢和无质粒的产LNnT的工程菌。主要研究内容如下:(1)通过共表达来自大肠杆菌K12的β-半乳糖苷通透酶(LacY)和来自脑膜炎奈瑟菌MC58的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)和β-1,4-半乳糖基转移酶(LgtB),以乳糖和胞内的尿苷二磷酸乙酰氨基葡糖(UDP-GlcNAc)和尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)为前体,实现了LNnT在枯草芽孢杆菌胞内的合成,产量达到0.61 g/L。然后通过优化关键酶LgtA和LgtB的表达量,有效地将LNnT产量提高到1.31 g/L。(2)采用模块化工程策略提高和平衡关键前体UDP-GlcNAc和UDP-Gal的供给。首先,采用过表达合成途径关键基因以及敲除分支途径关键基因的方法鉴定UDP-GlcNAc和UDP-Gal两个模块的关键酶。然后将每个模块中有利于LNnT产物合成的基因改造进行组装,分别获得4个不同强度的前体供给水平。在此基础上,将两个模块的不同强度进行组合,筛选到最优组合。最优组合是UDP-GlcNAc的中~+强度和UDP-Gal的中~+强度。在摇瓶发酵条件下,LNnT的产量达到1.95 g/L。最终,在3-L罐上,通过连续补料发酵LNnT的含量达到4.52 g/L。(3)通过利用木糖诱导的CRISPRi系统降低竞争途径中关键基因的表达至合适的水平,弱化竞争途径的代谢流,实现LNnT的胞内前体的合成模块与竞争模块(包括糖酵解途径(EMP),磷酸戊糖途径(HMP)和磷壁酸合成途径)之间的代谢流分配平衡,有效地提高了LNnT的合成效率。其中竞争模块的关键基因分别是糖酵解途径中的pfkA,pyk基因,磷酸戊糖途径中的zwf基因和磷壁酸合成途径中的mnaA基因。对竞争途径中的每个关键基因分别设计了8个不同抑制效率的sgRNAs,并通过单基因抑制筛选出对LNnT合成有效的sgRNA。然后,将筛选出的sgRNAs进行组合,将竞争途径中的4个关键基因同时进行下调,有效地弱化了竞争途径中的代谢流,从而提高LNnT的合成。进一步敲除基因组上编码UDP-葡萄糖-脱氢酶的tuaD基因,并在基因组上增加1个拷贝数来提高β-1,4-半乳糖基转移酶(LgtB)的表达水平,解除了从中间产物乳酸-N-三糖II(Lacto-N-triose II,LNTII)转化为LNnT的限速步骤。通过研究诱导剂木糖的添加时间和添加量对LNnT产量的影响,实现LNnT合成模块和三个竞争途径之间的最佳代谢通量的平衡。最终,在摇瓶培养条件下,重组枯草芽孢杆菌的LNnT产量达到2.30 g/L,在3-L罐上达到5.41 g/L。(4)利用启动子工程构建无芽孢和无质粒的产LNnT工程菌。首先,基于枯草芽孢杆菌潜在的内源强启动子以及已有报道的的枯草芽孢杆菌高强度启动子,构建拥有强表达潜力的第一启动子文库。在此基础上,将启动子截短至80～100 bp,以获得拥有较短序列的第二启动子文库。进一步从第二文库中筛选多个强启动子进行关键位点饱和突变和流式细胞筛选,获得具有最高强度的第三启动子文库。通过用强启动子文库中的不同强度启动子控制关键基因lgtA和lgtB的表达,筛选出最适表达水平,获得无质粒遗传稳定性较高的工程菌。然后,通过突变Spo0A启动子消除菌株的产芽孢能力。最终在摇瓶培养条件下,LNnT产量达到2.51 g/L。