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研究背景和目的:终末期肝病（end-stage liver diseases,ESLDs）是一种以肝功能严重异常并影响全身各个系统为表现的临床综合征,是肝病失代偿期进展为肝衰竭的统称。肝衰竭是由病毒、酒精、药物和缺血再灌注等病因引起的肝损害,肝衰竭作为一个高发病率、高死亡率的全球性公共卫生问题,ESLDs是严重危害国民健康和增加经济负担的重大疾病。原位肝移植（orthotopic liver transplantation,OLT）是ESLDs目前唯一有效的治疗手段,但其应用受到供体器官来源的限制。近年来,随着肝细胞在ESLDs治疗的基础研究取得了令人可喜的进展,利用肝细胞移植开展ESLDs的治疗已经成为大势所趋。但是肝细胞移植治疗ESLDs尚存在未解决的问题,例如:（1）缺乏充足非供体来源肝细胞,存在肝细胞来源短缺问题;（2）肝细胞经血管输注移植后,随血液循环流失,肝脏植入效率低下,最终定植入肝脏的细胞不足移植细胞的5%;（3）植入肝脏后的肝细胞增殖能力有限;（4）宿主对移植肝细胞存在免疫排斥等。探索可用于肝损伤修复的不同来源肝细胞,积极开展多种有效的移植策略是解决这些问题的关键。在肝细胞获取来源方面,诸多研究已经实现从多能干细胞诱导分化、成熟肝细胞谱系重编程、成体干细胞扩增后分化等途径获得具有原代肝细胞样特性的种子细胞。其中,（1）胆管树干细胞（biliary tree stem cells,BTSCs）作为存在于胆管内壁的胆周腺体内的成体干细胞,已从基因、细胞、发育、动物实验等方面被证实可分化为肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺内分泌细胞,是可用于肝脏功能损伤修复的理想种子细胞。（2）胎肝细胞（fetal liver cells,FLCs）因为可分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞,具有来源广泛、增殖能力强、细胞体积小等特点,已在肝脏功能损伤修复中展现理想效果。（3）通过小分子化合物组合对原代肝细胞进行谱系重编程,可获得在体外可大量扩增的肝前体细胞（hepatic progenitor cells,Hep PCs）。这些Hep PCs具有自我更新,高度增殖和向成熟肝细胞定向诱导分化的潜能。已有研究表明,原代肝细胞来源的Hep PCs经脾脏移植肝衰小鼠后,Hep PCs可定植于肝脏并分化,发挥成熟肝细胞的功能。除了BTSCs、FLCs和Hep PCs,骨髓和围产期组织来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）虽然不能直接分化成为肝细胞,但其通过免疫调节和旁分泌功能,已经在ESLD患者的临床治疗中展现出救治疗效。这些已经在基础研究和临床试验中被证实具有救治肝损伤功能的细胞,都为原代肝细胞移植应用所面临的瓶颈问题的突破提供解决方案。在移植策略的制定方面,目前临床常用的肝脏细胞治疗移植策略的主要通过血管输注移植。血管输注移植中的细胞通过与窦状内皮相互作用植入,细胞随血液循环流失严重,定植效率低,细胞阻塞血管,细胞异位定植等风险。目前已经有多种肝脏直接移植策略,为提高定植效率、降低栓塞风险提供了可能的备选方案,这些策略包括直接脏器注射、细胞膜片工程和补片移植（patch grafting）等。直接脏器注射移植可以实现细胞的肝内直接移植,但单剂注射体积和数量有限,注射导致的机械张力具有损伤肝脏生理结构的风险,尤其对于易于出血的纤维化和硬化肝脏患者。细胞膜片技术通过移植成熟细胞分泌的因子间接发挥效用,效用时间短暂。本课题组前期研究建立了通过将种子细胞包埋在软的（G*＜100Pa）透明质酸凝胶中,并置于脱敏蚕丝医用敷料构造的补片移植策略。通过该策略移植BTSCs会在1-3周内实现向整个肝脏的迁移,而定植入肝脏内的BTSCs会分化成熟,实现对肝损伤小鼠进行短期救治。对于补片移植的机制探讨证实,BTSCs分泌的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）家族成员MMP1和MMP2,尤其MMP2对细胞通过补片移植的成功至关重要。因此,利用MMP2作为其他可用于补片移植的细胞类型的筛选标志,将有可能极大地提高种子细胞筛选效率,通过筛选获得可向肝脏移植的种子细胞,从而实现对ESLDs的快速救治。同时,甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）作为Fah-/-小鼠（延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因剔除小鼠,肝衰竭小鼠模型即终末期肝病小鼠模型）病变的重要指标,因此,通过AFP的表达情况可以指示Fah-/-小鼠的救治情况。因此,本研究通过三个研究内容,使用MMP2筛选可用于补片移植开展终末期肝病治疗应用的不同来源的肝细胞;实现胆管树干细胞移植的长期有效性;探讨AFP作为Ⅰ型酪氨酸血症患者诊断和预后的标志物。本项目在课题组前期补片移植的基础上,进一步丰富了可用于补片移植的种子细胞类型、实现了ESLDs治疗中的应用,对于细胞移植治疗终末期肝病的基础研究转化为临床应用具有非常重要的意义。第1章适合补片移植救治肝衰小鼠的不同肝细胞来源类型的筛选研究目的:筛选不同来源肝细胞的补片移植实现Fah-/-小鼠救治的有效性。研究方法:1、获取小鼠胎肝细胞、通过观察细胞形态和大小,流式细胞术分选出胎肝细胞,胎肝细胞KM培养基形成类器官;细胞免疫荧光、荧光定量聚合酶链式反应（qpcr）检测CK19（细胞角蛋白19）、AFP（甲胎蛋白）、ALB（白蛋白）和HNF4α（肝细胞核因子4α）基因的表达进行鉴定并检测MMP2基因的表达;胎肝细胞补片移植;移植后疗效的评价包括:血清谷丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和白蛋白（ALB）的检测,免疫组化检测延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH,FAH免疫组化染色是染肝脏中外源细胞植入和增殖的肝细胞）在Fah-/-小鼠肝脏植入细胞中的表达。2、获取小鼠肝前体细胞,肝细胞经过有小分子化合物组成的TEM（肝细胞转化增殖培养基）培养重编程为肝前体细胞,肝前体细胞干性标志基因鉴定并检测MMP2基因的表达;肝前体细胞补片移植;移植后疗效的评价包括:血清ALT、AST和ALB的检测,免疫组化检测FAH在宿主肝脏中的表达。3、通过AAV-TBG-Cre对Rosa26-LSL-td Tomato小鼠的肝细胞进行标记,获取带红色荧光标记的肝细胞,并检测MMP2基因的表达;肝细胞补片移植;移植后疗效的评价包括:血清ALT、AST和ALB的检测,免疫组化检测FAH在宿主肝脏中的表达。4、获取绿色荧光蛋白（GFP）标记的人源脐带间充质干细胞（UC-MSCs,由上海市东方医院干细胞基地GMP实验室提供）,UC-MSCs形态学鉴定,表面标志物鉴定及成骨、成软骨和成脂肪分化鉴定;UC-MSCs通过病毒转染GFP;GFP标记的UC-MSCs补片移植;移植后疗效的评价包括:血清ALT、AST和ALB的检测,GFP标记的UC-MSCs植入肝脏的荧光示踪;UC-MSCs线粒体在宿主肝脏内表达的免疫组化。结果:1、胎肝细胞通过补片移植4周后Fah-/-小鼠ALT、AST可见升高、ALB可见下降,但ALT、AST和ALB数值明显好于对照组（补片+无细胞+撤NTBC组）,肝脏内可见胎肝细胞分化增殖的成熟肝细胞,免疫组化FAH表达。2、胆管样肝前体细胞通过补片移植4周后Fah-/-小鼠ALT、AST明显升高,ALB明显下降,ALT、AST和ALB数值与对照组比较无明显差别,肝脏内未见胆管样肝前体细胞分化成熟的肝细胞,免疫组化FAH不表达。3、肝细胞通过补片移植4周后Fah-/-小鼠肝脏内示踪未见红色荧光,ALT、AST明显升高,ALB明显下降,ALT、AST和ALB数值与对照组比较无明显差别,肝脏内未见成熟的肝细胞,免疫组化FAH不表达。4、UC-MSCs补片移植,Fah-/-小鼠肝脏内示踪可见绿色荧光,免疫组化UC-MSCs线粒体染色阳性,ALT、AST可见升高,但ALT、AST数值明显好于对照组,ALB明显下降,ALB数值与对照组比较无明显差别,肝脏内未见分化成熟的肝细胞,免疫组化FAH不表达。结论:1、MMP2机制实现干细胞补片移植至关重要。2、胎肝细胞通过补片移植可以救治Fah-/-小鼠实现救治的有效性,适合补片移植治疗终末期肝病。3、胆管样肝前体细胞MMP2的表达和肝向分化为成熟肝细胞的不足,未能实现补片移植救治终末期肝病。4、肝细胞缺乏MMP2的表达,细胞未能通过补片移植进入Fah-/-小鼠肝脏,未能实现补片移植救治终末期肝病。5、UC-MSCs通过补片移植进入Fah-/-小鼠肝脏改善肝功能,适合补片移植治疗终末期肝病。第2章补片移植胆管树干细胞治疗肝衰竭小鼠的长期有效性研究目的:补片移植实现胆管树干细胞治疗Fah-/-小鼠的长期有效性。研究方法:1、获取小鼠胆管树干细胞（mBTSCs）,久保田（KM）培养基mBTSCs原代培养。2、mBTSCs干性标志及其基因鉴定。3、mBTSCs补片移植。4、移植后疗效的评价包括:血清ALT、AST的检测,带绿色荧光蛋白mBTSCs植入肝脏的荧光示踪,免疫组化检测FAH在宿主肝脏中的表达,免疫组化检测AFP在宿主肝脏中的表达。研究结果:1、带绿色荧光蛋白的mBTSCs移植3周后在Fah-/-小鼠肝脏示踪见绿色荧光。2、mBTSCs通过补片移植3周后Fah-/-小鼠体内ALT、AST可见升高,但ALT、AST数值明显好于对照组。3、mBTSCs通过补片移植3周后,Fah-/-小鼠肝脏内可见mBTSCs分化成熟增殖的肝细胞,免疫组化FAH表达,但随移植时间延长,免疫组化FAH表达逐渐减弱。4、mBTSCs通过补片移植3月后Fah-/-小鼠的ALT、AST明显升高,ALT、AST数值与对照组比较无明显差别。5、mBTSCs补片移植3周后甲胎蛋白（AFP）极少量表达,但随移植时间延长,甲胎蛋白表达升高。结论:1、mBTSCs通过补片移植短期内可以救治Fah-/-小鼠,长期移植中Fah-/-小鼠微环境急剧改变,mBTSCs肝向分化为成熟肝细胞受阻,未能达到长期有效救治Fah-/-小鼠的作用。2、甲胎蛋白可能对Fah-/-小鼠的救治疗效有指示作用。第3章甲胎蛋白在不同来源肝细胞补片移植救治Fah-/-小鼠疗效中的指示作用研究目的:证明甲胎蛋白（AFP）在不同来源肝细胞补片移植中救治Fah-/-小鼠疗效中具有指示作用。研究方法:1、胎肝细胞补片移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP免疫组化检测。2、胆管样肝前体细胞补片移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP免疫组化检测。3、肝细胞补片移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP免疫组化检测。4、UC-MSCs补片移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP免疫组化检测。5、肝细胞脾脏移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP免疫组化检测。研究结果:1、胎肝细胞补片移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP极少量表达;肝细胞补片移植组,胆管样肝前体细胞补片移植组,人源脐带间充质干细胞补片移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP明显表达。2、肝细胞脾脏移植组Fah-/-小鼠肝脏AFP未见表达结论:甲胎蛋白在不同来源肝细胞移植救治Fah-/-小鼠疗效中具有指示作用。