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A型流感病毒是一种有囊膜、基因组分节段的单股负链RNA病毒。它在全球范围内的广泛流行导致了重大公共卫生安全问题,对人类的生存和发展构成重大威胁。与所有其他病毒一样,流感病毒在复制过程中与大量宿主蛋白存在直接或间接的相互作用。识别在病毒复制过程中发挥促进或抑制作用的宿主分子可以为抗流感病毒药物研发提供有价值的新靶点。TRIM家族蛋白具有多种不同的功能,参与细胞分化、凋亡、转录调控和信号转导等多种生物学过程,而且是宿主天然免疫系统抵抗病毒感染的重要效应因子。为了研究TRIM家族蛋白对流感病毒复制的调控作用,我们通过病毒蚀斑滴定实验检测了30种不同TRIM家族蛋白对流感病毒复制的影响,发现了多个具有抗流感病毒作用的TRIM家族蛋白,并且选择TRIM35作为深入研究的对象。利用IFN-β和ISRE启动子报告基因系统,我们验证了TRIM35在天然免疫信号通路中的正调节作用。研究发现,过表达TRIM35能够抑制流感病毒复制,siRNA干扰下调或敲除TRIM35表达能够促进流感病毒复制。另外,我们建立了Trim35基因敲除小鼠模型,利用A/WSN/33(H1N1)病毒感染后,发现与野生型对照组小鼠相比,TRIM35基因敲除小鼠体重下降更加明显直至全部死亡,而野生型小鼠全部存活。而且,病毒在基因敲除小鼠肺脏中复制滴度显著提高,导致更加严重的病理变化。我们通过对RIG-I信号通路中的主要节点分子进行初步筛选确定了TRIM35作用的靶点蛋白—TRAF3,免疫共沉淀(co-IP)实验验证了二者之间的相互作用,而且通过构建一系列截短突变体确定了二者结合的关键结构域为:TRIM35的PRY/SPRY结构域和TRAF3的RING结构域。此外,我们发现TRIM35通过对TRAF3进行K63泛素化修饰而对RIG-I信号通路发挥正调控作用,并且TRIM35的C36和C60位点是对TRAF3发挥K63泛素化修饰的关键位点。另一方面,我们通过co-IP实验发现流感病毒的10个主要蛋白中仅有PB2蛋白与TRAF3之间存在相互作用,并且发现病毒的PB2蛋白能够通过阻碍TRAF3的K63泛素化修饰从而抑制RIG-I信号通路的传递,进而抑制VISA-TRAF3复合物的形成。最后,我们发现TRIM35与流感病毒PB2蛋白之间也存在相互作用,而且TRIM35可以对病毒PB2蛋白进行K48泛素化修饰而导致其通过蛋白酶体途径降解,从而抑制病毒核糖核蛋白复合体(vRNP)活性和病毒复制。进一步研究发现,TRIM35的RING结构域是发挥抗病毒活性的关键区域,PB2的736位点则是TRIM35进行K48泛素化修饰的关键位点。综上所述,我们利用体外和体内实验揭示了TRIM35蛋白通过双重机制在RIG-I天然免疫和抗流感病毒感染中发挥的新作用,为抗流感药物的研发提供了新的思路。